原位雜交與凋亡檢測(cè)技術(shù)(存儲(chǔ)版)
【正文】 保存，時(shí)間不超過半年。g/ml， 時(shí)間 515分鐘； 標(biāo)記后洗脫液的濃度應(yīng)注意 (2 SSC) TdT酶易失效，應(yīng)在－ 20℃ 保存； TdT 酶和 DIGdUTP須臨時(shí)混合； 顯色時(shí)間鏡下控制可達(dá) 30分鐘以上。 食管鱗癌角化珠凋亡細(xì)胞， TUNEL法。 （ 2）固定液： 10%中性福爾馬林、4%多聚甲醛、 80%乙醇。 *PI染色因 PI同時(shí)與 RNA結(jié)合，應(yīng)先用 RNA酶消化（ 37℃ 15分鐘） 白血病細(xì)胞 HL60 APOBRDU 鼻咽癌細(xì)胞 Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡 400 （三）凋亡細(xì)胞的電鏡觀察： 組織處理：組織、細(xì)胞固定、包埋、 染色與一般電鏡標(biāo)本相同。 （ 2）防脫片： 1%牛血清白蛋白、卵蛋白、處理玻片。 試劑盒內(nèi)包括：蛋白酶 K， 含標(biāo)記探針的雜交液，封閉液及檢測(cè)系統(tǒng)等主要試劑；由于每種試劑都經(jīng)過最優(yōu)化檢測(cè)后配制， 所以成功率高，操作也簡(jiǎn)便，使原位雜交在一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行成為可能。 注意事項(xiàng)： 先做原位雜交（因 mRNA易被降 解），后做免疫組化。 1酒精脫水，二甲苯透明，封片。 滴加封閉液：室溫 20分鐘，不洗。 六、原位雜交實(shí)際操作舉例： DNA 與 mRNA原位雜交步驟 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟到水。 （ 九）顯示（使用檢測(cè)系統(tǒng)）： 放射自顯影（略）。 （六） 預(yù)雜交：用不含探針和硫酸葡聚糖的液體封閉非特異性雜交點(diǎn)。 玻片粘附劑：多聚賴氨酸， APES。 特點(diǎn)：長(zhǎng)度隨意，穩(wěn)定，信號(hào)更強(qiáng)。 特點(diǎn)：靈敏度高，輻射危害，耗時(shí)久，半衰期限制。 （ 三 ）核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)：根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)律 DNA： 多核苷酸鏈可形成雙螺旋三、四股螺旋；但有高溫變性，低溫復(fù)性的特點(diǎn)。 DNADNA。 液相雜交：以生物素或丫啶翁酯標(biāo)記探針在溶液中用羥基磷灰石層析或吸附、親和吸附、磁珠吸附等方法進(jìn)行雜交，結(jié)果于計(jì)數(shù)器，光度計(jì)或用化學(xué)發(fā)光測(cè)定。同年， BuongiornoNardelli等用同位素標(biāo)記 核酸探針對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行定位。 按探針的性質(zhì)分： DNA探針： 雙鏈：采用 PCR方法，從基因庫(kù)釣取或 人工合成。 四、原位雜交技術(shù)的應(yīng)用： 基因芯片（基因組圖）； 基因表達(dá)定位； 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)前一日置高 溫 （ 2400C） 烘烤，以破壞 RNA酶。 蓋玻片周圍加液體石蠟或用橡皮泥封固，以防雜交液蒸發(fā)。 將切片用 RNA酶或 DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后雜交。 PBS洗 3次 5分鐘，蒸餾水洗 1次。 1滴加生物素化羊抗兔 IgG， 370C， 30分鐘。 生殖細(xì)胞瘤 16號(hào)染色體 ISH HER2熒光原位雜交 皮膚鱗狀上皮細(xì)胞核 HPV DNA（ +） ISH 宮頸粘膜 上皮 HPV16（ +） ISH 宮頸粘膜上皮 HPV16（ +） ISH 宮頸鱗癌 HPV18(+)， ISH 鼻咽癌 EBER(+), ISH 腎小管上皮細(xì)胞核 HBVDNA（ +）， ISH 食管粘膜基底層細(xì)胞質(zhì) Egr1 mRNA（ +）， ISH 食管鱗癌細(xì)胞質(zhì) Egr1 mRNA（ +）， ISH 食管鱗癌細(xì)胞質(zhì) CyclinD1mRNA（ +）， ISH 胃腺癌細(xì)胞質(zhì)端粒酶hTR(+), ISH 肝細(xì)胞癌 CD44V6 mRNA（ +），
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