【正文】 縮性，以提高過(guò)濾速率和延長(zhǎng)過(guò)濾操作的周期。 液膜 即液體膜，是從生物膜奇妙的選擇性輸送功能上得到啟發(fā)而模仿的一種人工膜 微孔膜 孔徑為 ~20μ m的膜 動(dòng)態(tài)膜 在多孔介質(zhì) (如陶瓷管 )上沉積一層顆粒物 (如氧化鋯 )作為有選擇作用的膜，此沉積層與溶液處于動(dòng)態(tài)平衡 3．滲透、透析 、 反滲透 、超濾、和電滲析？ 滲透 是一個(gè)擴(kuò)散過(guò)程，在膜的兩旁，滲透壓差的作用下溶劑產(chǎn)生流動(dòng)。溶劑向膜面流動(dòng)（對(duì)流）引起溶質(zhì)向膜面流動(dòng)，當(dāng)溶質(zhì)向膜面的流動(dòng)速度與濃度梯度使溶質(zhì) 11 向本體溶液擴(kuò)散速度達(dá)到 平 衡 時(shí)，在膜面附近存在一個(gè)穩(wěn)定的濃度梯度區(qū)，這一區(qū)域稱為濃度極化邊界層，這一現(xiàn)象稱為 濃差極化 。所以，膜污染引起通量衰減往往是不可逆的。 溶質(zhì)濃度，料液流速與壓力的控制 5． 膜分離技術(shù)應(yīng)用實(shí)例？ 膜分離技術(shù)在純凈水處理中的應(yīng)用 它可以在超純水制 備中作為預(yù)處理手段，去除微生物、膠體和大分子物質(zhì)，以減輕反滲透和離子交換樹(shù)脂的負(fù)擔(dān)，提高出水質(zhì)量與再生經(jīng)濟(jì)效果，它也可以用在終點(diǎn)過(guò)濾，以去除微粒膠體、細(xì)菌和有機(jī)物。中水其實(shí)就是再生水，水質(zhì)介于上水和下水之間，故名 “中水 ”。熱原的致熱效能是很強(qiáng)的，人比動(dòng)物對(duì)熱原要敏感，所以熱原對(duì)人體的危害是相當(dāng)大的。 膜分離技術(shù)在生物化工中的應(yīng)用 在生物化工中，膜分離技術(shù)常被用于分離、濃縮、分級(jí)與純化生物產(chǎn)品，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品不同，用的膜分離技術(shù)組合也有所不同，見(jiàn)下圖生物化工流程與蛋白質(zhì)分離純化過(guò)程圖解（如圖 61 12） （ 1）微生物的分離與收集（ 2） 超濾分級(jí)（ 3）超濾親和純化（ 4）膜反應(yīng)器 超濾技術(shù)在膜生物反應(yīng)器中的應(yīng)用 膜生物反應(yīng)器是一種正在發(fā)展中的水凈化再生技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)是： ①固液分離率高 ②系統(tǒng)微生物濃度、容積負(fù)荷高 ③污泥停留時(shí)間長(zhǎng) ④污泥發(fā)生量少 ⑤耐沖擊負(fù)荷 ⑥出水水質(zhì)好 13 第 五 章 生物大分子的色譜分離和純化 1． 什么是 色譜分離 (Chromatographic Resolution， CR)？ 色譜分離 (Chromatographic Resolution， CR)也稱為色層分離或?qū)游龇蛛x，利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì) (如吸附力、分子極性、分子形狀和大小、分子親和力、分配系數(shù)等 )的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中。 在其他色譜條件相同的條件下，有效遷移距離 Leff 是隨溶質(zhì)的不同而變化的。 (二 ) 分配色譜 分配色譜 (Distribution Chromatography， DC)的流動(dòng)相和固定相都是液體，因而又稱 為液液色譜，其原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。 (四 ) 凝膠色譜 凝膠色譜 (Gel Chromatography， GC)以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩色譜 (Molecular Sieve Chromatography ， MSC)、 空間排阻色譜或尺寸排阻色譜 (Size Exclusion Chromatography， SEC)。目前，能夠用于蛋白質(zhì)復(fù)性的 LC 方法包括 HIC、 IEC、 SEC 與 AFC4 種。 高效疏水色譜 (HPHIC)因其廉價(jià)和純化后的蛋白具有生物活性而成為一種較新的發(fā)展前途廣闊的專門用于分離生物大分子的色譜方法，并且是一 種通用型的分離和純化蛋白的工具。 IEC 由于價(jià)廉和純化后的蛋白多保持原有活性，是另一種在生物大分子分離和純化中應(yīng)用廣泛的通用型色譜。另外它還有生產(chǎn)能力大、周期短、便于連續(xù)操作、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等優(yōu)點(diǎn)。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小的成分依次萃取出來(lái)。其操 作是向水相中加入溶入水的高分子化合物，形成密度不同的兩相，輕相富含某一種高分子化合物；重相富含鹽類或另一種高分子化合物。 蛋 白質(zhì)分離純化的一般步驟 前處理 粗分級(jí) 細(xì)分級(jí) 4．蛋白質(zhì)含量測(cè)定 的方法？ 在著手提純蛋白質(zhì)以前，首先要建立一個(gè)分析方法。對(duì)于不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，這一點(diǎn)很重要。蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，因此有雙縮脲反應(yīng)。為提高測(cè)定靈敏度，又發(fā)展了微量雙縮脲法。 雙縮脲法 在復(fù)雜生物體系中需要快速測(cè)定其中蛋白質(zhì)的含量時(shí)，最常用此法。這取決于所用方法的化學(xué)基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)的純化方法 從原理上看可分為幾種類型：一是利用一種蛋白質(zhì)相對(duì)于其它蛋白質(zhì)溶解度不同的 沉淀法 ；二是依據(jù)蛋白質(zhì)在兩相間分配作用不同的 相分配法 ；三是利用蛋白質(zhì)對(duì)固體載體的吸附性質(zhì)不同，通過(guò)柱層析方式將它們分別洗脫下來(lái)的柱層析法 ；四是依據(jù)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)或離心場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速度不同的 電泳法或離心法 。但對(duì)于生物大分子，如蛋白質(zhì)和酶，加入有機(jī)相會(huì)使其失活。 5． 了解 鹽析效應(yīng) ？ 無(wú)機(jī)鹽類如硫酸銨、氯化鈉等一般可降低產(chǎn)物在水中的溶解度而使其更易于轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相中，另一方面還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。 溶劑萃取是利用一種溶質(zhì)組分， (如產(chǎn)物 )在兩個(gè)互不混溶的液相 (如水相和有機(jī)溶劑相 )中競(jìng)爭(zhēng)性溶解和分配性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行分離操作的。前者是指固定相上的配基對(duì)一類基團(tuán)有極強(qiáng)的親和力，后者的配基僅對(duì)某一種蛋白有特別強(qiáng)的親和性，如 單克隆抗體對(duì)抗原的特異性吸附就屬此類。 14． 了解 色譜技術(shù)的應(yīng)用？ SEC 在工業(yè)生產(chǎn)的分離、純化聚合物和蛋白質(zhì)中用得很多。 (3) 根據(jù)洗脫操作時(shí)展開(kāi)方式的不同，可分為洗脫展開(kāi)法、前沿分析法和置換展開(kāi)法 3 種。 (二 ) 分配色譜 分配色譜 (Distribution Chromatography， DC)的流動(dòng)相和固定相都是液體，因而又稱為液液色譜，其原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。 (1) 目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特性、及分子量的大??； (2) 主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)的成分與含量； (3) 目的產(chǎn)物在色譜分離過(guò)程中生理活性的穩(wěn)定性。/year 4． 基因工程菌培養(yǎng)液中所要除去的生物大分子雜質(zhì) 有哪些？ 蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類 5．在色譜操作中的術(shù)語(yǔ)？ 在色譜操作中，加入洗脫劑而使各組分分層的操作稱為 展開(kāi) (Development)，洗脫時(shí)從柱中流出的溶液稱為 洗脫液(Eluate)，而展開(kāi)后各組分的分布情況稱為 色譜 (Chromatography)。 工藝簡(jiǎn)單：預(yù)處理 超過(guò)濾 灌封 超濾技術(shù) 在輕工、食品中的應(yīng)用 膜分離技術(shù)應(yīng)用于輕工業(yè)也逐步成為現(xiàn)實(shí)。 （ 4 ）生物處理法和膜分離技術(shù)結(jié)合 中水回用新技術(shù)膜生物反應(yīng)器（ MBR），具有出水水質(zhì)穩(wěn)定，運(yùn)行成本低，操作簡(jiǎn)單、維護(hù)方便等特點(diǎn)，出水水質(zhì)完全符合國(guó)家中水回 用標(biāo)準(zhǔn)。 采用膜集成技術(shù)處理電鍍廢水典型工藝 采用膜集成技術(shù)為電鍍廢水處理提供完美解決方案，促進(jìn)電鍍工業(yè)技術(shù)升級(jí)。 溶液 pH 控制 溶液 pH 對(duì)蛋白質(zhì)在水中溶解性，荷電性機(jī)構(gòu)型有很大影響。 膜污染是指處理物料中的微粒、膠體粒子或溶質(zhì)大分子由于與膜存在 物理化學(xué)相互作用或機(jī)械作用 而引起的在膜表面或膜孔內(nèi)吸附、沉積造成膜孔徑變小或堵塞，使膜產(chǎn)生透過(guò)流量與分離特性的不可逆變 化現(xiàn)象。 4．膜的濃差極化 與膜污染 ？ 如何控制膜污染？ 濃差極化是指在分離過(guò)程中，料液中的溶劑在壓力驅(qū)動(dòng)下透過(guò)膜， 溶質(zhì)被截留 ，于是在膜表面與臨近膜面區(qū)域濃度越來(lái)越高。相對(duì)應(yīng)的有中性膜。硅藻土不規(guī)則粒子間形成許多曲折的毛細(xì)孔道，藉篩分和吸附作用除去懸浮液中的固體粒子。 當(dāng)轉(zhuǎn)鼓繼續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)，生成的濾餅依次被洗滌、吸干 (洗滌吸干區(qū) )和刮下卸除 (卸渣區(qū) )。 真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī) 對(duì)于 大規(guī)模生物工業(yè)生產(chǎn) ，真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)是常用的過(guò)濾設(shè)備之一。 濾餅過(guò)濾按推動(dòng)力的不同可以分為四種，即 重力過(guò)濾、加壓過(guò)濾、真空過(guò)濾和離心過(guò)濾 。 當(dāng)懸浮液通過(guò)濾層時(shí)，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，這種方法叫做澄清過(guò)濾。如圖 3－ 5所示為并流 型傾析式離心機(jī)工作原理圖，懸浮液從進(jìn)料管徑進(jìn)料口進(jìn)入高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓內(nèi)，在離心力作用下，固體顆粒發(fā)生沉降分離，沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上。 管式離心機(jī)設(shè)備簡(jiǎn)單，操作穩(wěn)定，分離效率高。但由于管式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓直徑較小，容量有限，因而生產(chǎn)能力較小。 碟片式離心機(jī)的分離因數(shù)為 1000～ 20200，適應(yīng)于細(xì)菌、酵母菌、放線菌等多種微生物細(xì)胞懸浮液及細(xì)胞碎片懸浮液的分離。 碟片式離心機(jī) 碟片式離心機(jī)是沉降式離心機(jī)的一種， 1877 年由瑞典的 DeLaval 發(fā)明，是目前工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。 路線②應(yīng)用了 膜分離技術(shù) ，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以分開(kāi)；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，因此這條路線的 問(wèn)題較多 。此法不增加液體體 積，不降低蛋白質(zhì)濃度，但時(shí)間較長(zhǎng)，易形成蛋白質(zhì)沉淀。值得指出的是， 包含體顆粒內(nèi)并不一定都是表達(dá)產(chǎn)物 ，也可能含有其他雜質(zhì)，如核酸、脂類、雜蛋白等，主要取決于表達(dá)系統(tǒng)。 與下游過(guò)程結(jié)合 7 細(xì)胞破碎與固 液分離緊密相關(guān)，對(duì)于可溶性產(chǎn)品來(lái)講，碎片必須除凈，否則將造成層析柱和超濾膜的堵塞，縮短設(shè)備的壽命。 （ 1）培養(yǎng)過(guò)程控制 在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)胞生長(zhǎng)后期，加入某些能抑 制或組織細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑制劑（如青霉素、環(huán)絲氨酸等），繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，新分裂的細(xì)胞其細(xì)胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞內(nèi)產(chǎn)物不經(jīng)破碎即可直接滲透出來(lái)。由于導(dǎo)電率的大小與微生物種類、處理?xiàng)l件、細(xì)胞濃 度、溫度和懸浮液中原電解質(zhì)的含量等有關(guān)，因此，正式測(cè)定前應(yīng)預(yù)先采用其他方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于破碎前的細(xì)胞，可利用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)。事實(shí)上， 在微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，大多都能產(chǎn)生一定的水解自身細(xì)胞壁上聚合物結(jié)構(gòu)的酶，以便使生長(zhǎng)繁殖過(guò)程進(jìn)行下去。如在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液 pH 調(diào)至偏酸性范圍 (pH2～ 3)或較堿性范圍 (pH8～ 9)使蛋白質(zhì)凝固，一般以酸性下除去的蛋白質(zhì)較多。 3． 什么是等電點(diǎn) ？ 等電點(diǎn)沉淀法 ? 對(duì)于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在酸性條件下帶正電荷，在堿性條件下帶負(fù)電荷，而在某一 pH 值下，凈電荷為零，稱為等電點(diǎn)。除此之外，選擇和使用助濾劑的要點(diǎn)如下： (1) 根據(jù)目的產(chǎn)物選擇助濾劑品種 (2) 根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)和過(guò)濾情況選擇助濾劑品種 (3) 粒度選擇 (4) 使用量的選擇 五、加入反應(yīng)劑 加入某些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對(duì)過(guò) 濾的影響，從而提高過(guò)濾速率。首先加入電解質(zhì)，使懸浮粒子間的雙電層電位降低、脫穩(wěn)，凝聚成微粒，然后再加入絮凝劑絮凝成較大的顆粒。 絮凝效果與絮凝劑的加量、相對(duì)分子質(zhì)量和類型、溶液的 pH、攪拌轉(zhuǎn)速和時(shí)間等因素有關(guān)。 對(duì)絮凝劑的 化學(xué)結(jié)構(gòu) 一般有下列兩方面的要求，一方 面要求其分子必須含有相當(dāng)多的活性官能團(tuán)，使之能和膠粒表面相結(jié)合；另一方面要求必須具有長(zhǎng)鏈的線性結(jié)構(gòu)，以便同時(shí)與多個(gè)膠粒吸附形成較大的絮團(tuán)，但相對(duì)分子質(zhì)量不能超過(guò)一定限度，以使其具有良好的溶解性。6H三氯化鐵 FeCl3這種雙電層的結(jié)構(gòu) 使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài) 。 等電點(diǎn)法提取工藝 操作簡(jiǎn)單，收率 60％。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方法之一。 升高溫度可有效降低液體粘度 ，提高過(guò)濾速率，如 12176。它包括三方面內(nèi)容： 即 清潔生產(chǎn)工藝（技術(shù)）、清潔產(chǎn)品、清潔能源 。 （ 4） 成品制作 成品形式與產(chǎn)品的最終用途有關(guān)。 70 年代以來(lái)，逐漸開(kāi)發(fā)出各種色譜 (層析 )技術(shù)，如親和色譜、疏水色譜、聚焦色譜、離子交換色譜和凝膠色譜等，后兩種技術(shù)已開(kāi)始用于批量生產(chǎn)。 (4)、第三代生物技術(shù) 第三代生物技術(shù)一般認(rèn)為以 20 世紀(jì) 70 年代末掘起的 DNA 重組技術(shù)及細(xì)胞融合技術(shù)為代表。古代的技術(shù)比較原始，工場(chǎng)大多是家庭作坊式的，產(chǎn)物基本不經(jīng)過(guò)后處理而直接使用，當(dāng)然也就沒(méi)有上下游技術(shù)之說(shuō)了。 2．生物工程下游技術(shù)的發(fā)展歷程？ (1)、 古代釀造業(yè) 生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的歷史可追溯到古代的釀造業(yè)，它包括釀酒、制醬（油）、醋、酸奶和干酪等。這期間借鑒和引進(jìn)吸收了大量的近代化學(xué)工業(yè)的分離技術(shù)，據(jù)報(bào)道有 80%的化工單元操作技術(shù)被引入生物工業(yè)。生物大分子的純化一直是個(gè)難題。 （ 3） 精制（高度純化） 目的是除去與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。 6．清潔生產(chǎn) (Cleaner Production） ？ 清潔生產(chǎn)（ Cleaner Production）是指將綜合預(yù)防的環(huán)境保護(hù)策略持續(xù)應(yīng)用于生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品中，以期減少對(duì)人類和環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)。而且，單從過(guò)濾操 作看，稀釋后過(guò)濾速率提高的 百分比 必須 大于加水比 才能認(rèn)為有效，即若加水一倍，則稀釋后液體的粘度必須下降 50％以上才能有效提高過(guò)濾速率。 二、調(diào)整 pH pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié) pH值可改善其過(guò)濾特性。此外，細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個(gè) pH 值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過(guò)濾的進(jìn)行。在生理 pH 值下，發(fā)酵液中的菌體或蛋白質(zhì)常常有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用，使溶液中帶相反電荷的陽(yáng)離子被吸附在其周圍，在界面上形成 雙電層 。18H20(明礬 )、氯化鋁 AlCl3當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的