【正文】 上，平放在培養(yǎng)皿的“U”形玻棒上，再將稈銹菌夏孢子或白粉菌的分生孢子輕輕彈落或涂抹在瓊脂平面上。 (一)萌發(fā)率 即萌發(fā)一定時間后，隨機(jī)取一定數(shù)目(至少 500 個)的孢子，檢查萌發(fā)的孢子數(shù)，求出萌發(fā)百分率，如果用該法記錄兩種或幾種不同處理時，要注意嚴(yán)格掌握檢查時間。因此接種方法也不相同。塑料罩保濕48 小時后揭布，正常管理，7 天后作發(fā)病調(diào)查。 ：取白梨以酒精火焰表面消毒后，用熾熱的解剖刀，在其上切成小手指粗的孔穴 3—5 個。　　圖上要有比例尺，以表示各部的大小，圖下要寫名稱和標(biāo)圖注。筆尖含黑的多少，壓筆力的大小，常引起線點(diǎn)的粗細(xì)變化，要多加體會運(yùn)用。否則是紅是紫不易區(qū)分。在已活化并在16—28℃恒溫箱中培養(yǎng)16—18小時的白菜軟腐病菌斜面上加3—5毫升先在恒溫箱中經(jīng)予熱的無菌水，靜置10—20分鐘，使細(xì)菌游出配成稀薄的菌懸液，注意靜置的時間不能太長，因?yàn)闀r間長了鞭毛可能脫落、染色固定前可在鏡下觀察其游動性。實(shí)訓(xùn)二鞭毛菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)、壺菌綱和卵菌綱真菌的主要形態(tài)特征，掌握與植物病害有關(guān)的重要屬的基本形態(tài)特征、分類依據(jù)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)。　　1)水霉屬(Saprolegnia)　　鏡檢培養(yǎng)皿中用線麻籽或大米粒誘發(fā)培養(yǎng)的水霉菌，注意菌絲和游動孢子27 / 66囊的形態(tài)，菌絲和游動孢子囊區(qū)別是否明顯?次生游動孢子囊是否從初生游動孢28 / 66子囊的空殼內(nèi)生出(層生)?藏卵器內(nèi)卵孢子數(shù)是一個，還是多個；能否看到藏卵29 / 66器和雄器交配?能否看到游動孢子釋放的現(xiàn)象。　　(3)單軸霉屬(Plasmopara)　　觀察葡萄霜霉病()標(biāo)本，注意為害部位及癥狀特點(diǎn)，挑取葡萄霉病病葉病斑上的霉層制片(或取制備片 015)鏡檢孢子囊梗的形態(tài)，注意分枝特點(diǎn)及分枝末端的特征?！　?．霜霉為害植物時，為什么多發(fā)生在葉部?為什么多在病斑背面形成霉層?為什么常在低溫多濕的條件下受害嚴(yán)重.31 / 66實(shí)訓(xùn)三　接合菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)　　熟悉與植病關(guān)系密切的接合菌的形態(tài)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)，同時觀察真菌的異宗配合現(xiàn)象?！　±珙^霉屬(Absidia)　　產(chǎn)生匍匐絲和假根，孢囊梗自假根間的弓形匍匐絲上長出，配囊柄上長出附屬絲包圍32 / 66接合孢子?！　?2)布氏白粉屬(Blumeria)　　該屬是從白粉屬(Erysiphe)劃出來的一個新屬，主要特征是閉囊殼上的菌絲狀附屬絲很短，閉囊殼內(nèi)有多個子囊，分生孢子?；颗虼蟪式蛐?。39 / 66　　2 球殼目(Sphaeriales)40 / 66　　球殼目真菌的子囊果為真正的子囊殼，有真正的孔口，孔口乳突狀或長筒狀，子囊有41 / 66圓形、棍棒形、紡錘形，一般排列成子實(shí)層，子囊間大都有側(cè)絲，也有的早期消解或沒有，42 / 66球殼菌一般都有很發(fā)達(dá)的分生孢子階段?！　?4)綠核菌屬 (擬黑粉菌屬，Ustilaginoi?！　?6)球針殼囊 (Phyllactinia)　　取桑里白粉病()和梨白粉病標(biāo)本觀察癥狀特點(diǎn)，并制片(或取制備片)鏡檢附屬絲的形態(tài)，注意附屬絲生在閉囊殼的赤道部位，剛直，基部膨大呈球形，閉囊殼內(nèi)子囊多個。　　(二) 不整囊菌綱(Plectomycetes)　　(三) 核菌綱(Pyrenomycetes)　　　　1 白粉菌目 Erysiphales　　白粉菌都是專性寄生菌，菌絲、無性和有性繁殖體多表生，以吸器伸入寄主表皮細(xì)胞吸取養(yǎng)分，子囊果為閉囊殼，其上生有各種形狀的附屬絲，根據(jù)附屬絲的性狀和閉囊殼內(nèi)33 / 66子囊的數(shù)目進(jìn)行分類，常見的有以下七屬。通常形成小型孢子囊，小型孢子囊聚生在孢子囊梗頂端膨大的頭狀體的小梗上，其中形成一個孢子，故也稱這種小型孢子囊為分生孢子。　　3．鏡檢鑒定大蔥霜霉病、向日葵霜霉病，波菜霜霉病的病原菌，鑒定到屬。觀察菌絲有沒有隔膜?游動孢子囊形狀?與菌絲差別是否明顯?能否看到孢子囊萌發(fā)的情景?泄管和泡囊的形態(tài)如何? 　　2)疫霉屬(Phytophthora) 　　取馬鈴薯晚疫病()標(biāo)本，觀察受害部位。　　(三)卵菌綱(Oomycetes)　　卵菌的特征是營養(yǎng)體為真正的菌絲體；無性繁殖產(chǎn)生具有一根尾鞭和一根茸鞭的游動孢子，有性繁殖通過異型的雄器和藏卵器交配產(chǎn)生卵孢子，根據(jù)藏卵器內(nèi)卵孢子數(shù)目的多少及其他特性，卵菌綱分為水霉目和霜霉目兩個目。3．使用二甲苯擦鏡頭時，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂?！　」┰嚲辏喊撞塑浉【?)　　操作步驟：　　A 載玻片準(zhǔn)備　　用新的載玻片，經(jīng)過系列清潔處理(方法從略) 后，進(jìn)行檢驗(yàn)，合格者用于實(shí)驗(yàn)。　　B 染色步驟 (染色劑配法見附3)　　a 滴草酸銨結(jié)晶紫液于涂片上，染色1分鐘；　　b 傾去染液，水洗(亦可不用水洗)；　　c 加碘液處理1分鐘；　　d 傾去碘液、水洗、吸水紙吸干； 　　e 用95% 酒精洗脫染液，時間約30秒鐘；　　f 吸干后，滴加復(fù)染劑藏紅〇復(fù)染10—30秒鐘；　　g 水洗、吸干鏡檢。點(diǎn)要點(diǎn)得圓，點(diǎn)得勻，點(diǎn)子的排列，要保持整齊、均勻，均勻中求變化，在變化中間要統(tǒng)一，所以應(yīng)有計(jì)劃(心中有數(shù)) 地從明處點(diǎn)起，小心而慢慢的點(diǎn)，一行行交互著點(diǎn)，不要等到畫好看得太疏而再加點(diǎn)子，再加的點(diǎn)子反而會變得不均勻，明的部分，色淡的部分點(diǎn)子小些稀些，暗的部分，色深的部分點(diǎn)子要大些密些?！　　　⒘蛩峒埫捎诔醺迳厦枥L，在用鉛筆時，筆頭必須削尖，輕描以便修改和保持圖面清晰，橡皮要軟而不帶顏色，以免沾污畫面。以免流出孔穴，另一培養(yǎng)皿的菜幫以同法處理作為重復(fù)。(三)涂抹法(小麥稈銹病) 這也是氣流傳播的病害常用的接種方法，用于禾本科銹病接種。因此，接種是植病工作者必須掌握的基本技術(shù)環(huán)節(jié)。滅菌后皿底加少許滅菌水，將濾紙條橫放在載玻片上，崩緊，兩端拖入水中，吸滴水，再在紙上滴一滴玉米瘤黑粉病菌黑粉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，在 25℃溫箱中培養(yǎng)，逐日檢查萌發(fā)的結(jié)果。 (三)瓊脂培養(yǎng)基法 對于某些不適于直接在水滴中萌發(fā)的真菌可采用此法。 (一)懸滴法 1 材料：玉米大斑病菌斜面菌種。 1 病組織材料 小麥根腐病黑胚粒 5 粒。 分離時，在新的水爛斑邊緣挑取少量病組織在無菌水試管中配成菌懸液，取滅菌培養(yǎng)皿 3 付，標(biāo)好次序，其內(nèi)各置無菌水 1 毫升，用移置環(huán)移取菌懸液一環(huán)，放在第 1 皿水中混合均勻，從中挑取一環(huán)稀釋液至第 2 皿，再以同法稀釋成第 3 皿，取熔化后冷至 45℃左右的(一般將化好的培養(yǎng)基瓶靠近鼻尖，以不燙為度)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每皿倒約 15 毫升，沿著桌面輕輕搖勻，凝固后倒置于 26—28℃的溫箱中培養(yǎng)，1—2 日后可見白色，圓形或近圓形直徑為 1—2 毫米的菌落，從中選典型菌落用移植環(huán)（劃線法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每組轉(zhuǎn) 4—5 管，注意過早出現(xiàn)的大型菌落多為腐生細(xì)菌。 (1)葉斑病類病原菌的分離（玉米大斑病病菌的分離） 取玉米大斑病病葉，在病、健交界處剪取 2—3 毫米長的病組織。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其他基物中將病原菌單獨(dú)分選出來，叫作分離。 (4)壓力表的指針上升時，鍋內(nèi)溫度也逐漸升高，當(dāng)壓力表指針升至 15 磅時，蒸氣溫度相當(dāng)于 120℃—121℃(等于一個大氣壓)，此時開始計(jì)算滅菌時間，控制熱源，使處于 15磅壓力保持 30 分鐘，即能達(dá)到完全滅菌的目的，然后停止加溫。 (2)將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有一定的空隙以便流通空氣。調(diào)節(jié) pH 至中性的簡便方法是用石蕊示紙。1 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA） 這是植病實(shí)驗(yàn)室最常用的培養(yǎng)基(簡稱 PSA)，主要用于植物病原真菌的分離和培養(yǎng)，有時也用于植物病原細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)室中通常將通草、接骨木或向日葵的莖髓，剪成適當(dāng)大小，浸于 70%酒精中備用。切片時先選取材料并作適當(dāng)?shù)男拚宰笫值氖持负湍分改笞〔牧?，中指頂住材料下端，使材料上端突出于手指以?2—3 毫米。 3 撥：對于產(chǎn)生在植物表皮下或半埋生于基物內(nèi)的病原體孢子器官。(一)整體封藏法 對于生長在植物病部表面或培基上的菌絲體、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及線蟲等，可直接擇取少許封藏在適當(dāng)?shù)母≥d劑中，在顯微鏡下觀察，根據(jù)材料的特點(diǎn)和觀察的目的可采用不同的方法封藏制片。引起的病害如蘋果樹腐爛病、梨干腐病、蘋果及梨輪紋病、棉花褐斑病、芹菜斑枯病、茄子褐紋病等。[大孢鏈格孢(A. macrospora )引起棉花輪紋斑病]。④葡萄孢屬(Botrytis )分生孢子梗無色，頂端細(xì)胞膨大成球形，上面有許多小梗；分生孢子單胞，無色，橢圓形，著生小梗上聚集成葡萄穗狀。頂部產(chǎn)生菌鍵型的分生節(jié)孢子(粉孢子)。層菌常產(chǎn)生有性孢子，很少產(chǎn)生無性孢子。⑥柵銹菌屬（Melampsora）冬孢子單細(xì)胞，無柄，排列成整齊的一層；夏孢子表面有疣或刺。梨銹?。℅. haraeanum ）冬孢子階段在檜柏上，性孢子和銹孢子在梨樹上引起梨銹病。②子囊盤有些從菌核或假根菌核上長出，③盤菌一般很多不產(chǎn)生分生孢子。無性世代很發(fā)達(dá)，包括在葉點(diǎn)菌屬和莖點(diǎn)菌屬。（4）腔菌①主要特點(diǎn)A、子囊著生在子座的空腔內(nèi)，子囊間無側(cè)絲，子囊具雙層壁 。C、囊孢殼屬（Physalospora）無子座。D、病害癥狀：引起樹皮腐爛、潰瘍、瘤腫和枝枯；侵害果實(shí)引起腐爛和輪紋等癥狀。如：桑樹有桑表白粉，桑里白粉。在病部形成白粉或小黑點(diǎn)。C、子囊盤—盤狀或杯狀，頂端開口大。子囊壁有的單層壁，有的雙層壁,有的囊壁成熟后溶解，有的不溶，有的子囊頂有孔口，有的無孔口。簡單的僅為單細(xì)胞，但大多數(shù)有發(fā)達(dá)的菌絲體，菌絲有隔，每個細(xì)胞有一個、二個、多個核，壁以幾丁質(zhì)為主，營養(yǎng)體可以形成厚垣孢子。已知接合菌亞門分 2 個綱、7 個目、約 600 個種。(5)白銹菌屬(Albugo)①活體寄生物，菌絲在寄主細(xì)胞間蔓延，以吸器伸入寄主細(xì)胞內(nèi)吸收營養(yǎng)。③如引起黃瓜、茄子等幼苗瘁倒病的病菌，都屬于腐霉屬。(4)葉上斑點(diǎn)，若由疫霉引起，病斑較大，暗褐色圓形水漬病斑；若由霜霉引起，病斑較小，黃色至褐色，邊緣不明顯，病斑受葉脈限制呈多角形，后期在病斑上長出白色至灰白色霜狀霉層。每個游動孢子具單鞭或雙鞭兩種類型。目 錄第一部分 微生物病理基礎(chǔ)知識 ................................................................................11－1 鞭毛菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) ................................................................11－2 接合菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) ................................................................31－3 子囊菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) ................................................................41－4 擔(dān)子菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) .................................................................71－5 半知菌亞門及其所致病害的特點(diǎn) ...................................................................8第二部分 微生物病理實(shí)驗(yàn)基本操作 ..........................................................................92－1 植物病理徒手制片技術(shù) .............................................................................92－2 培養(yǎng)基的配制和滅菌 ...................................................................................112－3 植物病原菌的分離和培養(yǎng) .......................................................................152－4 真菌孢子的萌發(fā) ...........................................................................................182－5 植物病原物的接種 .......................................................................................202－6 植物病原生物繪圖技術(shù) .................................................................................21第三部分微生物病理技能訓(xùn)練 ..................................................................................23實(shí)訓(xùn)一 植物病原細(xì)菌觀察 .......................................