【正文】 于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來(lái)水。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。1%，%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器1530分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。陰性則為無(wú)反應(yīng)。目視標(biāo)本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性，顯色清晰者為陽(yáng)性。a． 陽(yáng)性判定值陽(yáng)性判定值（cutoff value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥NCX，并≤NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX；如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測(cè)定所沿用。計(jì)算方法主要也有兩種，即陽(yáng)性判定值法和抑制率法。b. 抑制率法抑制率表示標(biāo)本在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合中標(biāo)本對(duì)陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計(jì)算：抑制率（%）= （陰性對(duì)照A值標(biāo)本A值）100%/陰性對(duì)照A值一般規(guī)定抑制率≥50%為陽(yáng)性，＜50%為陰性。到70年代，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制進(jìn)入一個(gè)新的階段全面質(zhì)量管理，推行Good Laboratory Parctice（簡(jiǎn)稱(chēng)GLP）。 基本概念 質(zhì)量控制（Quaility Control,）質(zhì)量控制是監(jiān)視全過(guò)程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個(gè)管理過(guò)程。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進(jìn)行時(shí)，按時(shí)間順序而抽選出來(lái)的，其目的是檢測(cè)檢驗(yàn)過(guò)程中變異的可追查性原因。通過(guò)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理和開(kāi)展質(zhì)量控制工作是可以避免的。換言之，當(dāng)ELSIA檢測(cè)同一樣本達(dá)一定次數(shù)后所得的一組數(shù)據(jù)，其中靠近均值（X）的177。通過(guò)可靠的決定性方法測(cè)出的值，稱(chēng)為靶值，通常用靶值來(lái)表示真值的大小。參考標(biāo)準(zhǔn)血清 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料。 質(zhì)控血清的使用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心制備的乙肝標(biāo)志物質(zhì)控血清，可以在20℃保持半年定值不變。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。5） 抽濾除菌。 室內(nèi)質(zhì)量控制程序臨床檢驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，每次或每天之間不可能沒(méi)有誤差。相反，如果將允許誤差定得過(guò)大，將使監(jiān)測(cè)系統(tǒng)察覺(jué)不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義。從這20個(gè)數(shù)據(jù)中，求出OCV的X和SD。通過(guò)質(zhì)控控制各項(xiàng)條件，使RCVK的數(shù)據(jù)盡可能接近OCV值。ELISA試驗(yàn)中，各種檢驗(yàn)項(xiàng)目的誤差允許范圍均有待在實(shí)踐中得出結(jié)論，以上只是舉例說(shuō)明質(zhì)控方法，不是定論。第③、④種情況，單獨(dú)依靠記錄往往是不易察覺(jué)的，但在質(zhì)控圖上可以清晰地發(fā)現(xiàn)這種失控。數(shù)值處于告警和失控狀態(tài)應(yīng)舍去，重新測(cè)定該項(xiàng)質(zhì)控血清和病人樣本。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的精密度，而室間質(zhì)評(píng)主要控制試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，不能互相替代。 這種評(píng)價(jià)方式有一定缺點(diǎn)，即各實(shí)驗(yàn)室常對(duì)質(zhì)控物特殊對(duì)待，在檢驗(yàn)時(shí)選用特殊試劑盒，選派特別的技術(shù)員進(jìn)行檢驗(yàn)，有的實(shí)驗(yàn)室互相和對(duì)結(jié)果并作修改。各實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果報(bào)到質(zhì)控中心，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，得出相互比較的結(jié)果。4)將SDI上限、SDI下限值與SDI值中的數(shù)字比較。如果OCV檢驗(yàn)的結(jié)果仍是好的，說(shuō)明常規(guī)操作出現(xiàn)問(wèn)題。利用質(zhì)控圖可以對(duì)每次檢驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)沒(méi)有更換另一批號(hào)試劑盒和另一批號(hào)質(zhì)控血清時(shí)，該質(zhì)控圖可以連續(xù)作下去。如果RCVK的SD值更小，說(shuō)明OCV不是最佳條件下測(cè)定的，應(yīng)重新再測(cè)OCV。并作雙份測(cè)定，得出2個(gè)吸光值（A值），求出X。對(duì)任何一個(gè)試驗(yàn)都應(yīng)確定一個(gè)允許的誤差范圍，前題是滿(mǎn)足臨床要求。2030次測(cè)定結(jié)果刪除177。4） 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS緩沖液）將收集的血清稀釋至所需的濃度。 臨界值質(zhì)控血清質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如果出現(xiàn)超過(guò)允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗(yàn)不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測(cè)標(biāo)本。 標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品 由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用肯定的、公認(rèn)的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測(cè)定的定值材料。 真值用確切的、最理想的決定性方法測(cè)得的值，稱(chēng)為真值。2SD，　　　　X177。檢驗(yàn)工作中隨機(jī)誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進(jìn)行。因?yàn)镋LISA是目前臨床上最常用的一種免疫學(xué)檢驗(yàn)方法，就以ELISA檢驗(yàn)為例，介紹一下有關(guān)問(wèn)題。ELISA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見(jiàn)圖42。而且應(yīng)≥NCX并≤NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX；如有2個(gè)陰性對(duì)照A超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競(jìng)爭(zhēng)抑制物的量，此時(shí)反應(yīng)最為敏感。也有寫(xiě)作P/N的，這里的P不代表陽(yáng)性(positive)，而是病人（patient）的縮寫(xiě)，不應(yīng)誤解。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽(yáng)性對(duì)照（P）、和陰性對(duì)照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。兩類(lèi)反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。 結(jié)果判斷 定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出有或無(wú)的簡(jiǎn)單回答，分別用陽(yáng)性、陰性表示。超出可測(cè)上限的A值常以*或over或其它符號(hào)表示。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 保溫在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。　參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的45個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品最好也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。試劑盒供應(yīng)尿素過(guò)氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。OPD本身難溶于水，OPD在間接測(cè)定抗體時(shí)，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定，也可應(yīng)用這種稀釋液。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。使用過(guò)濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過(guò)低，則又影響檢測(cè)的敏感性。 按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。 　結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。 封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過(guò)濾法。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。?。例如，在檢測(cè)抗DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。小試管還可以當(dāng)作比色杯，最后直接放入分光光度計(jì)中比色。在ELISA中，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加?？刂品磻?yīng)條件。以微量滴定板最為常用，專(zhuān)用于EILSA的產(chǎn)品稱(chēng)為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為812的96孔式?！∶庖呶絼┮寻豢乖蚩贵w的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定IgM抗體，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。抗HBe的檢測(cè)一般采用此法。 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗抗體。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。ELISA技術(shù)講座二原理與分類(lèi)這樣可以通過(guò)洗滌將游離的Ab※除去，結(jié)合標(biāo)記物的測(cè)定可在固相上進(jìn)行。5． 標(biāo)記的免疫測(cè)定如上所述，免疫測(cè)定是一種很敏感的測(cè)定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測(cè)定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá)5~10μg/ml，但在臨床檢驗(yàn)中，某些待測(cè)物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。　敏感性在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），隨來(lái)源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?！∽钸m比例在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見(jiàn)圖14?！】乖贵w反應(yīng)　可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→AgIgM是由五個(gè)單體組成的五聚體，含10個(gè)重鏈和10個(gè)輕鏈，具有10個(gè)抗原結(jié)合價(jià)，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。Ig分五類(lèi)，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 全過(guò)程 。 終 ； ，加樣板過(guò)多造成加樣后放入孵箱前等待時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(特別是室內(nèi)溫度較高時(shí))； 。 選擇試劑 選擇質(zhì)量?jī)?yōu)良的檢測(cè)試劑，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，操作前將試劑在室溫下平衡3060分鐘。 樣 ，洗板針暢通，洗完板后最好在吸水紙（選擇干凈、無(wú)或少塵的吸水材料）上輕輕拍干； ，或多用幾臺(tái)洗板機(jī)。 應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。ELISA技術(shù)講座一抗原與抗體的反應(yīng)　抗體　抗體的結(jié)構(gòu)抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。① 木瓜酶裂解部位）2，能和兩個(gè)相同的抗原結(jié)合；另一片段類(lèi)似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無(wú)生物活性。用親和層析法提取的特異性抗體，稱(chēng)為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測(cè)定中可得到更好的效果。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG）的實(shí)際中必須應(yīng)用只對(duì)hCG特異的抗βhCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。5) 另外，也可利用純化的抗原檢測(cè)標(biāo)本中的抗體，例如抗HBs等。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay），簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA，在國(guó)內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的，雖然含義不完全確切，但已習(xí)用。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。采用F（ab39。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。另外，在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋?zhuān)?:40~1:200），以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。甲型肝