【正文】 學(xué)分析證實(shí)其相關(guān)性表達(dá)，另一方面將通過免疫熒光雙標(biāo)記法分別標(biāo)記 cMaf 和 IL4，將 PBMC 9 爬片進(jìn)行激光共聚焦掃描，進(jìn)行精確的定位定量分析，從形態(tài)學(xué)上直接證實(shí)兩者的相關(guān)性表達(dá) 。 ⑥ 抽提 PBMC 基因組 DNA，亞硫酸氫鈉修飾后進(jìn)行純化回收，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)IL4 啟動子區(qū)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，隨后將 PCR 產(chǎn)物與 T 載體連接、轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選，然后挑克隆送測序，根據(jù)測序結(jié)果判斷 PBMC中 IL4啟動子區(qū) CpG 島是否發(fā)生 去 甲基化，并結(jié)合標(biāo)本 對應(yīng)的 臨床資料，分析該基因異常甲基化與 多發(fā)性硬化 的相關(guān)性。采用 Protein A/G PLUS Agarose 瓊脂糖樹脂洗脫蛋白 DNA 復(fù)合物，加熱樣品取消交聯(lián)，純化出 DNA 片段，然后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增分析，檢測 cMaf、 EHR 和 MAREs 是否均與 IL4啟動子區(qū)結(jié)合以及 啟動子區(qū)組蛋白是否發(fā)生 去 甲基化修飾 。 （ 2）成熟的技術(shù)平臺 本項(xiàng)目已具備良好的前期研究基礎(chǔ)，課題所使用的關(guān)鍵技術(shù)如 RNA 干擾 、靶向納米材料的制備和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以及 EAE 動物模型建立等均已建立了成熟的技術(shù)平臺，為本課題的完成提供了技術(shù)保障。因此，本項(xiàng)目實(shí)施所需的實(shí)驗(yàn)條件完全具備，僅需補(bǔ)充試劑等消耗性用品及購買部分儀器配件及耗材。 1996 年開始至今一直擔(dān)任神經(jīng)內(nèi)科行政副主任，現(xiàn)任 中華醫(yī)學(xué)會廣州疼痛分會副主委 ，中華醫(yī)學(xué)會廣東神經(jīng)免疫學(xué)組副組長。 高聰 *， 謝富華 ， 殷建瑞 ， 楊潔 ， 馮欣 ， 馬鵬程 。實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 20xx； 24(1)： 20 － 23。 20xx－ 20xx年在青島醫(yī)學(xué)院攻讀碩士學(xué)位期間研究方向?yàn)樯窠?jīng)免疫疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》， 20xx； 33(Z1)： 14－ 19。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：高聰，項(xiàng)目即將結(jié)題 。聯(lián)合基因治療組生存期明顯大于其他組。 ２ .已具備的實(shí)驗(yàn)條件 ,尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑 (包括利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況 ) 本課題是一跨學(xué)科的研究，將以廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院為平臺完成整個實(shí)驗(yàn)過程。另附該已結(jié)題項(xiàng)目已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁復(fù)印件 (限三篇 )。 合作單位１ (公章 ) 合作單位２ (公章 ) 合作單位３ (公章 ) 2. 申請者所在單位領(lǐng)導(dǎo)的審查意見與保證 已對申請書內(nèi)容進(jìn) 行了審核 ,申請書填報(bào)內(nèi)容屬實(shí)并保證在項(xiàng)目獲得資助后做到以下幾點(diǎn) : (１ )保證對研究計(jì)劃實(shí)施所需的人力、物力和工作時間等條件給予支持； (２ )嚴(yán)格遵守廣東省自然科學(xué)基金管理委員會有關(guān)資助項(xiàng)目管理和財(cái)務(wù)管理的各項(xiàng)規(guī)定； (３ )督促項(xiàng)目負(fù)責(zé)人和本單位科研管理部門按廣東省自然科學(xué)基金管理委員會的規(guī)定及時報(bào)送有關(guān)報(bào)表和材料。因此，本項(xiàng)目實(shí)施所需的實(shí)驗(yàn)條件完全具備，僅需補(bǔ)充試劑等消耗性用品及購買部分儀器配件及耗材。所需的納米材料 PEIPEGPLL已通 過中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院帥心濤教授研究組進(jìn)行合成。 19 圖 1 復(fù)合物在 N/P＝ 15 綠色熒光蛋白表達(dá)水平（ BBRC: Impact factor： ） 圖 2 大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)瘤模型和治療效果（ Biomaterials: Impact factor: .） 如圖 2－圖 4，我們采用立體定向腦內(nèi)注射瘤細(xì)胞成功建立了 Wistar 大鼠的 腦內(nèi) C6膠質(zhì)瘤模型，分別采用 CD、 TRAIL 單基因治療或 CD/TRAIL 聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn) CD、 TRAIL單基因治療組較未治療對照組的腫瘤平均體積明顯小，而聯(lián)合治療組的腫瘤平均體積最小。取得預(yù)期的科研成果，結(jié)題中 。 梁兵 *，肖中鵬，李藝，孔祥復(fù)，帥心濤，彭英。實(shí)用診斷與治療雜志， 20xx； 05： 323－ 325。 高聰 *，鄭健箏，區(qū)騰飛。小膠質(zhì)細(xì)胞活化在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的作用機(jī)制。 15 四、研究條件與基礎(chǔ) １ . 已取得的研究工作成績及與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累（對于自由申請項(xiàng)目，請著重填寫申請人近期的主要工作業(yè)績；對于重點(diǎn)項(xiàng)目，請著重填寫本課題組與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和近五年的主要研究業(yè)績） 工作基礎(chǔ)： （ 1）申請人簡介： 申請人高聰， 教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。工作人員有從事分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)人員，還配有細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)元培養(yǎng)的專門實(shí)驗(yàn)室及技術(shù)員。 技術(shù)路線： 可行性分析： （ 1）堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ) 前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已明確表明 cMaf 在 MS 患者血液和腦脊液 PBMC 中 低 表達(dá)，提示檢測 cMaf和 IL4在 MS病人的血液和腦脊液中的相關(guān)性表達(dá) 在 PBMC 細(xì)胞中過表達(dá)和干擾 cMaf 在 PBMC 細(xì)胞中過表達(dá)和干擾 IL4 cMaf 通過組蛋白 去 甲基化 調(diào)控 IL4 參與MS 發(fā)病 cMaf 對 IL4的轉(zhuǎn)錄啟動 EHR與 IL4啟動子結(jié)合 cMaf、 EHR 和MAREs 形成復(fù)合體 IL4 啟動子去甲基化 觀察 cMaf 和 IL4 表達(dá)失調(diào) 對多發(fā)性硬 化發(fā)病的影響 熒光素酶報(bào)告基因 免疫共沉淀 ChIP 直接測序法 RTqPCR 和 western blot 檢測 cMaf 和 IL4 表達(dá) 13 cMaf 參與 MS 發(fā)病的分子機(jī)制。 ② 按照免疫共沉淀 試劑盒 說明書操作，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，即采用 RIPA buffer溫和 裂解 PBMC/cMaf 細(xì)胞 ， 抽提蛋白后進(jìn)行定 量，向稀釋后的總蛋白中加入 cMaf 抗體，將抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行孵育，然后利用試劑盒的 AminoLink Plus Coupling Resin 捕捉抗原抗體復(fù)合物，將沉淀下來的蛋白復(fù)合體進(jìn)行 western blot，通過 cMaf、 EHR 和 MAREs的相應(yīng)抗體檢測三者之間是否存在相互作用。實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行，具體步驟如下：已固定的 PBMC 細(xì)胞爬片經(jīng)血清封閉后，使用 mouse anti IL4 antibody（ sc28361）和 rabbit anticMaf antibody（ sc7866）同時進(jìn)行一抗孵育， PBS 緩沖液洗片后用不同標(biāo)記的二抗即 Alexa Fluor 555conjugated antirabbit antibody（ CatCST4413）和 Alexa Fluor 555conjugated antimouse antibody（ CatCST4408）同時孵育，充分洗片后封片觀察，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡掃描成像 。 （ 3） 檢測 cMaf 對 IL4 啟動子區(qū)組蛋白 去 甲基化和 CpG 島 去 甲基化的影響 建立穩(wěn)定過表達(dá) cMaf 的鼻咽癌細(xì)胞株，首先通過熒光素酶報(bào)告基因檢測 cMaf 能否抑制 IL4 的轉(zhuǎn)錄，然后通過免疫共沉淀檢測 cMaf、 EHR 和 MAREs 是否存在相互作用形成復(fù)合體，接著利用染色質(zhì)免疫共沉淀（ chromatin immunoprecipitation, ChIP）檢測cMaf、 EHR 和 MAREs 與 IL4 啟動子區(qū)結(jié)合以及組蛋白發(fā)生 去 甲基化 反應(yīng) ，最后采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ bisulfite genomic sequencing PCR, BSP）檢測 IL4 啟動子區(qū) CpG島的甲基化，明確 cMaf 通過招募一系列效應(yīng)蛋白形成復(fù)合體 使 IL4 啟動子區(qū)的組蛋白甲基化， 以 進(jìn)一步 明確 組蛋白 去 甲基化是否引起 IL4 啟動子區(qū) CpG 島 去 甲 基化，從而揭示 多發(fā)性硬化 中 IL4 基因表達(dá)受抑制的分子機(jī)理。124:8894. 13 Leng J, Yao H, Shen J, Wang K, Zhuo G, Wang Z: Coexpression of il18 binding protein and il4 regulates th1/th2 cytokine response in murine collageninduced arthritis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 20xx。361:14371447. 4 Kang H, Choi TW, Ahn KS, Lee JY, Ham IH, Choi HY, Shim ES, Sohn NW: Upregulation of interferongamma and interleukin4, th cellderived cytokines by soshihotang (shosaikoto) occurs at the level of antigen presenting cells, but not cd4 t cells. J Ethnopharmacol 20xx。 IL4 與其中任何一種受體結(jié)合都能激活 STAT6。在 Th 細(xì)胞分化過程中，細(xì)胞因子被認(rèn)為是最重要的因素。 cMaf缺陷小鼠 CD4+T細(xì)胞 IL4的合成障礙，而 IL IL IL13的合成不受影響。在前期研究中，通過基因芯片技術(shù)篩選出多個與 多發(fā)性硬化 發(fā) 病 密切相關(guān)的候選基因 。 參加單位數(shù)──指研究項(xiàng)目組主要成員所在單位數(shù)，包括主持單位和合作單位 (合作者所在單位 )，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。 如涉及多學(xué)科可填寫兩個，先填寫主學(xué)科。 本項(xiàng)目如獲成功 ，不但為 多發(fā)性硬化 發(fā)生機(jī)理提供新的理論依據(jù)，還將為尋找 多發(fā)性硬化 的分子標(biāo)志物和基因治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一次出現(xiàn)的縮寫詞 ，須注出全稱。外來語要同時用原文和中文表 達(dá) 。 cMaf表達(dá) 降低導(dǎo)致 IL4的 表達(dá)也降低， 從而導(dǎo)致 MS 發(fā)病 。 申報(bào)學(xué)科──申請項(xiàng)目所屬的最基礎(chǔ)學(xué)科。首次申請廣東省自然科學(xué)基金的單位，尚未編入單位代碼，其代碼應(yīng)向廣東省自然科學(xué)基金管理委員會辦公室申請后填寫。 為了探尋 多發(fā)性硬化 的發(fā) 病 機(jī)理，項(xiàng)目申請人所在的研究團(tuán)隊(duì)一直致力于篩選并鑒定調(diào)控 多發(fā)性硬化 發(fā) 病 的關(guān)鍵基因。 cMaf是最早被克隆的 Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子，僅特異性地表達(dá)于 Th2細(xì)胞，而不表達(dá)于 Th1細(xì)胞 [6]。 Th1/Th2 極化是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， Th1/Th2 平衡失調(diào)是許多疾病的分子免疫基礎(chǔ)，因而 Th1/Th2 極化已成 目 研究的新熱點(diǎn) [10]。 IL4 有二種受體：一種包含 IL4Rα和 γ，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過激活 JAK1 和 JAK3；另一種包含 IL4Rα和 IL13R，通過激活 JAK JAK2 和 TYK2 起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。255 Suppl 6:26.