【正文】 h， 將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記 ，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基 ， 再培養(yǎng) 。 ? 以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至 50℃ 的 MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿 ， 然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置 ， 培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營養(yǎng)因子 。 質(zhì)粒載體 二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型 抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。 4．當(dāng)培養(yǎng)物 OD600在 ～ ，開始收獲細(xì)胞 (大約需 2～ )． 5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻 10min。 13．于 37℃ 培養(yǎng)過夜。 目的基因的獲取 ? 一、通過建立基因文庫分離靶基因 ? 基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。 DNA擴(kuò)增 PCR反應(yīng) DNA片斷的克隆 載體的條件 ： a 復(fù)制起點(diǎn) b 適宜的限制酶切點(diǎn) c 選擇標(biāo)記 ? DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組 DNA技術(shù)的關(guān)鍵 。 轉(zhuǎn)化時(shí) ， 細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA的狀態(tài) ，然后利用短暫熱休克使 DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中 。 進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu) 、 功能 ， 或表達(dá)該基因的產(chǎn)物 。 重組 DNA的鑒定 遺傳學(xué)方法 第七節(jié) 雜交育種 (一 )細(xì)菌雜交 ? 在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類尚不多 ， 主要是大腸桿菌 ， 其他還有鼠傷寒沙門氏菌 、 銅綠假單胞菌 、淋病奈氏球菌等 。 ? 酵母雜交 ? 一般而言 ， 雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期 ， 將不同基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞 ， 經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀 。 (三 )遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程 。 4． 涂布于再生培養(yǎng)基 ， 再生出菌落 。 在放線菌和細(xì)菌中 ， 制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等 。 ? (2)對(duì)已知微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾。 ? 在預(yù)篩選時(shí) ， 多用瓊脂平扳擴(kuò)散抑菌法 。 菌種篩選方法 ? 誘變處理后，突變細(xì)胞只占存活細(xì)胞的百分之幾，而能使生產(chǎn)狀況提高的細(xì)胞又只是突變細(xì)胞中的少數(shù)。 特殊變異菌的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進(jìn)行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細(xì)胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，菌生長(zhǎng)速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長(zhǎng)速率較快。 一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件 (1) 經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在； (2) 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型 ， 特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力 。 ? 冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難 。 ? 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： ? 1． 離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞； ? 2． 用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞； ? 3． 加入等體積的 20％ 甘油或 10％ 二甲亞砜； ? 4． 混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中 ， 于 70℃ 超低溫冰箱中保藏 。 如果無控速冷凍機(jī) ， 則一般可將安瓿或液氮瓶置于一 70℃ 冰箱中冷凍 4h， 然后迅速移入液氮罐中保存 。 當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到 40℃ 時(shí)啟動(dòng)真空泵 ， 使真空度達(dá)到 ～。 6． 15min后，將歧管與真空泵相通。 (三 )凍干菌種的保藏與再生 1． 保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于 5℃ 下保藏 。 ? 此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì) ， 且不要求任何特殊的設(shè)備 。 ? 浸沒保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng) ， 然后注入經(jīng) 170℃ 下滅菌 12h的礦物油 ， 礦物油的用量以高出培養(yǎng)物 1cm為宜 。 ? 當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí) ， 抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓 。 ? 成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏 6個(gè)月 、 1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率 (或存活單位 )。 ? 加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測(cè)保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性 。 質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長(zhǎng)非必需 。 ? 可用于絲狀真菌 、 酵母 、 細(xì)菌和放線菌的保藏 。 其他保藏方法 一、傳代保藏 二、礦物油中浸沒保藏 一、傳代保藏 ? 將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代 ， 然后在一定的生長(zhǎng)溫度下生長(zhǎng)和保存的傳代保藏方法 。 13． 關(guān)閉真空泵 。 將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中 ， 然后調(diào)節(jié)溫控裝置 。 而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏 ， 便于運(yùn)輸 。 (二 )液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1．待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入 5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液； ～ lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶， (2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積 20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散； 氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于 5℃ 冰箱中 3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 ? 這一方法雖簡(jiǎn)便易行 ， 但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏 。 為了獲得滿意的冷凍結(jié)果 ， 通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑 。 ? 3) 誘導(dǎo)抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時(shí)存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時(shí)，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無法正常生長(zhǎng)，只有組成型變異株能夠利用底物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。 具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。 菌種篩選的手段 ? 初篩 ? 從菌體形態(tài)變異分析 ? 平皿快速檢測(cè)法 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長(zhǎng)圈法和抑制圈法等 ? 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 ? 如果認(rèn)為是有實(shí)用前途的代謝產(chǎn)物 ， 則要進(jìn)一步大量培養(yǎng) ， 并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn) 、 毒性考查 、 藥物代謝等實(shí)驗(yàn) ， 并進(jìn)行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作 ， 以備投入生產(chǎn) 。 ? 這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動(dòng)物體內(nèi)治療試驗(yàn) 。 ? 4．酶處理溫度 ? 5．破壁時(shí)的 pH值 ? 6．滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和 KCl和 NaCl等無機(jī)物。 為的是確證融合的成功 ， 可以采用多標(biāo)記菌種 。 2． 原生質(zhì)體制備 。 一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn) (一 )雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體 。 兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配 ， 恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間 ， 則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配 。 ? 三 、 菌落快速裂解鑒定法 ? 從平板上直接挑選菌落裂解后 ， 直接電泳檢測(cè)載體質(zhì)粒大小 ， 判斷有無插入片段存在 ， 該法適于插入片段較大的重組子初篩 。 重組克隆的篩選與鑒定 ? 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落 ， 并鑒定重組子的正確性 。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì) ， 將重組 DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法 。 ? 使 DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長(zhǎng)）反應(yīng)。 載體應(yīng)具備以下條件： ? １、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制； ? ２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源 DNA插入； ? ３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子； ? ４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體 DNA與宿主 DNA便于分離； ? ５、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。再插入冰中．加入 37℃ 靜置培養(yǎng) 90min。 2．取 50ml肉湯中，無菌添加 ／ LMgCl2，于 37℃ 振蕩培養(yǎng)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異 ， 同一質(zhì)粒在不同條件下 ， 拷貝數(shù)也可能差異很大 ， 有嚴(yán)緊型和松弛型兩種 。 培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出 ， 就可測(cè)得所需營養(yǎng) 。 ? 用接種針或牙簽將 CM上長(zhǎng)出的菌落在 MM和CM兩副平板上接種 ， 依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種 ，然后一起培養(yǎng) ， 觀察其生長(zhǎng)情況 。 ? 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法 ? 1． 將一較平皿直徑小 1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨 ， 用金屬夾夾住 ， 滅菌 。 營養(yǎng)缺陷型的用途 ? 營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大 。 ? (二 )操作步驟 1． 單孢子懸液制備 取斜面 ， 加入 6ml ／ L ， 用接種環(huán)刮下孢子 ， 振蕩試管 ， 立即通過帶濾紙漏斗過濾 ， 由此制得單孢子懸液 ， 若孢子液渾濁狀 ， 其孢子濃度可達(dá) l06個(gè)／ ml， 此為待處理孢子懸液 。 4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。 初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的 ， 以量為主 。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑 ， 它能造成不可回復(fù)的缺突變 。 而用電離輻射 177。 ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種 ， 是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量 、 性能的主要手段 。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 。 ? (3)改良菌種的評(píng)價(jià) (包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集 。 有時(shí) ， 真菌子實(shí)體形成必須有光線 ， 這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮 。 ? 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。 （三）培養(yǎng)基的組成原則 ? 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的 。 次代培養(yǎng)及純化步驟 涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后 ， 如生長(zhǎng)出菌落 ， 則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類 。 ? 土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取 添加及未添加富集底物 (如幾丁質(zhì)、纖維素等 )的土浸出汁平板。 加入培養(yǎng)基中的天然提取物 ， 部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳 、 氮源 ，如幾丁質(zhì) 、 纖維素或果膠 。 ? 由于表層水中含有泥沙 ， 故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣 。 如果層次要求不嚴(yán)格 ， 可取離地面 5～15cm處的土 。 一、成功的分離培養(yǎng)方法 (1)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程； (2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)； (3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過程 。 純種分離的方法有劃線分離法 、 稀釋分離法 。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標(biāo)記 ， 記錄采樣時(shí)間 、 地點(diǎn) 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 ? 增殖： 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì) 。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ，快速 、 準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來 。 這些特性包括形態(tài) 、 培養(yǎng)特征 、