【正文】 目的基因的獲取 ? 一、通過建立基因文庫(kù)分離靶基因 ? 基因文庫(kù)包括兩類：基因組文庫(kù)：利用限制性內(nèi)切酶。 它們之間是互補(bǔ)的 ， 在適當(dāng)條件下可以再連接一起 。 13．于 37℃ 培養(yǎng)過夜。 10．加入 1～ 20μ l待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 DNA溶液。 4．當(dāng)培養(yǎng)物 OD600在 ～ ，開始收獲細(xì)胞 (大約需 2～ )． 5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻 10min。 四、遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞游離的DNA片段，將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀。 質(zhì)粒載體 二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型 抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。 基因重組 一、質(zhì)粒的特點(diǎn) 質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動(dòng)必需 。 ? 以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至 50℃ 的 MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿 ， 然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置 ， 培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子 。 生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法 ? 將缺陷型菌株培養(yǎng)后 ， 收集菌體 ， 制備成細(xì)胞懸液 ， 與 MM培養(yǎng)基 (融化并涼至 50℃ )混合并傾注平皿 。 (三 )夾層法 ? 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基 ， 凝固后涂上一層含菌的 MM， 凝固后再倒一薄層 MM瓊脂培養(yǎng)基 ， 培養(yǎng) 24h， 將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記 ，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基 ， 再培養(yǎng) 。 ? 此法要求平皿上菌落不能太多 ， 菌落之間應(yīng)有一定間隔 。 ? 3． 將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓 ， 此菌印模即復(fù)印于上 。 ? 菌絲過濾法：對(duì)于霉菌 ， 因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體 ， 就可用濾紙過濾法將菌絲濾去 ， 而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過 。 要研究代謝途徑 ， 育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料 。 ? 與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型 。 3．誘變處理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子懸液中， 30℃ 振蕩 30min，立即稀釋 1000倍停止作用，然后以 102， 104兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)，30℃ 3天后計(jì)數(shù)。 其精確的作用機(jī)制尚不很清楚 ， 據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸 ， 直接作用于細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制系統(tǒng) ， 從而誘發(fā)了變異 。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 在正式照射前 ， 應(yīng)先開紫外線 10min， 讓紫外燈預(yù)熱 ， 然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射 10～ 50s。 (二 )操作步驟 1． 將細(xì)菌培養(yǎng)液以 3000r／ min離心 5min， 傾去上清液 ， 將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌 。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。因此在具體方法上就有差異 . 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者 ， 而將 90%的菌落淘汰 。 這樣 ， 隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來 ， 若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng) ，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能 ， 形成混雜菌落 ，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化 。 (三 )誘變處理 根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹 ， 結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際 ， 設(shè)計(jì)誘變處理方案 。 5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 二、誘變育種步驟 ?出發(fā)菌株的選擇 ?處理菌懸液的制備 ?誘變處理 ?中間培養(yǎng) ?分離和篩選 (一 )出發(fā)菌株的選擇 1． 自然界新分離的野生型菌株 ， 對(duì)誘變處理較敏感 ， 容易達(dá)到好的效果 。 3． 吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷 。 大部分誘變劑是致癌劑 ， 所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎 ， 要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸 ，且切勿吸入其蒸氣 ， 有人對(duì)某些誘變劑極其敏感 ， 甚至未直接接觸就會(huì)過敏 ， 這就更要當(dāng)心 。 使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)： 大多數(shù)情況下 ， 就突變數(shù)量而言 ， 要比電離輻射更有效 。 許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線 ，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室 、 中小型工廠都適用 ， 也很安全 。 ? c. 賦予菌種對(duì)多種底物 ， 特別是價(jià)廉而豐富的底物的利用能力 ， 由此可降低操作費(fèi)用 。 提高特定基因的表達(dá)水平 ? (1)引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào) ， 可通過在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動(dòng)子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號(hào) ， 提高基因效力等 。 (4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶 。 ? 如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少 ，則多半采用隨機(jī)誘變 、 篩選及選育等技術(shù)： ? 如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí) ， 則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種 。 工業(yè)菌種育種的方法 ? 誘變 ? 基因轉(zhuǎn)移 ? 基因重組 育種過程 ? 包括下列 3個(gè)步驟： ? (1)在不影響菌種活力的前提下 ， 有益基因型的引入 。 七、生產(chǎn)選種 ? 是在長(zhǎng)年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中 ， 在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下 ， 突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大 ， 這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞 ， 在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件 ， 并逐漸顯示出它的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì) ， 這種優(yōu)勢(shì)的發(fā)展 ， 促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露 。 ? 植物材料中真菌的分離：植入法 ， 壓貼法 ， 洗滌法 ， 浸泡法 。 富集可以是種水平的，如通過營(yíng)養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。 這里主要是利用營(yíng)養(yǎng)成分的減少而使生長(zhǎng)減慢 ， 并由此限制真菌的遷涉生長(zhǎng) 。 ? 通過高倍放大進(jìn)行鏡檢 ， 可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況 。 ? 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。 ? 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮 ， 以抑制真菌的繁殖 。 ? 樣本采集完后 ， 應(yīng)及時(shí)處理或在 4℃ 下貯存 ，貯存試樣處應(yīng)與劃線 ， 篩選平板分開 ， 貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng) 。 篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后 ， 按生長(zhǎng)出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素 、 菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組 。 ? 另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌 “ 附著材料 ” ， 如無菌的植物組織或土壤浸出液 。 ? 水中細(xì)菌的分離：水樣通過 ，取出濾膜用 1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。 富集方法 ? 運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長(zhǎng)因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。 瓊脂平板在使用前應(yīng)置于 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 l、2天。 (二 )生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基 的組成原則 加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量 、 環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類 。 如果有急流存在的話 ， 應(yīng)直接將瓶口反向于急流 。 將洗凈的根裝入采樣袋中 ， 采集根系時(shí) ，一般與根際土樣一起保存 。 ? 在采集植物根際土樣時(shí) ， 一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根 ， 在大量無菌水中浸漬約 20min， 洗去粘附在根上的土壤 ， 然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土 ， 這部分上卻為根際土樣 。 采樣的注意事項(xiàng) 采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無菌； 所采集的樣本必須具有某種代表性； 采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期 、 地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理 、 生態(tài)參數(shù)等； 應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素 ， 因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的； ? 采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于 4℃ 下，但貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。 選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測(cè)方法 。 ? 在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中 ， 應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測(cè)方法 ， 以與各種不同類型的生長(zhǎng)和代謝之微生物相適應(yīng) 。 （五）毒性試驗(yàn) ? 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的 ，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心 ， 尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種 ， 更應(yīng)慎重 。 因此還必須分離 ， 純化 。 （二）增殖培養(yǎng) ? 為了容易分離到所需的菌種 ， 讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加 ， 可以通過配制選擇性培養(yǎng)基 ， 選擇一定的培養(yǎng)條件來控制 。 采樣的對(duì)象也可以是植物 ， 腐敗物品 ， 某些水域等 。 ? 發(fā)酵性能測(cè)定： 進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定 。 ? 定方案： 首先要查閱資料 ， 了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性 。第四章 生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏 主講人：韓北忠 劉 萍 帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種 顯微觀察裝置 第一節(jié) 菌種的分離簡(jiǎn)介 一、菌種的來源 ? 根據(jù)資料直接向有科研單位 、 高等院校 、 工廠或菌種保藏部門索取或購(gòu)買； ? 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 。 ? 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。 ? 分離： 利用分離技術(shù)得到純種 。 一般園田土和耕作過的沼澤土中 ， 以細(xì)菌和放線菌為主 ，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 ， 酵母和霉菌較多 ， 如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi) 。 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 ， 宜將樣品逐步分批寄回 ， 以便及時(shí)分離 。 （三）培養(yǎng)分離 ? 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著 ， 但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài) 。 （四）篩 選 ? 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 ， 通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn) ， 以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種 。 ? 到目前為止 ， 還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類 。 二、培養(yǎng)分離中要解決的問題 “ 分離什么和從哪里分離出 ?” 必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力 、 生長(zhǎng)速度 、 生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費(fèi)用 ， 工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等 。 ? 樣本采集時(shí)所需的工具通常有無菌刮鏟 、 土樣采集器 、 鑷子 、 解剖刀 、 手套 、 無菌小塑料袋和塑料瓶等 。 將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中 。 ? 采集植物根及根系時(shí) ， 方法與根際土樣采集方法相似 。 ? 方法是：握住采樣瓶底浸入水中 3050cm處 ， 然后瓶口朝下打開瓶蓋 ， 讓水樣進(jìn)入 。 所有水樣都應(yīng)在 24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測(cè) ，或者 4℃ 下貯存 。 所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑 (如放線菌酮和制霉素 )，摻加濃度一般為 50μg／ m1， 以抑制真菌的生長(zhǎng)。 ? 但對(duì)某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng) 。 ? 植物體上細(xì)菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取 1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。 ? 培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長(zhǎng) 。 用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上 。 ? 所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性 。 除嗜溫性放線菌外 ， 其他放線菌一般在培養(yǎng) 420天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落 。 放線菌的分離 ? 土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。 次代培養(yǎng)及純化 ? 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異 ，作初步的鑒定和區(qū)分 。 六 、真菌分離 利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散 ， 利于計(jì)數(shù)