【正文】 白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定 推斷 預(yù)測 氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)） → 空間結(jié)構(gòu) （高級結(jié)構(gòu)） → 功能 （一） 蛋白質(zhì)測序的一般步驟 祥見 P116 （ 1） 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 （二） 蛋白質(zhì)測序的基本策略 對于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從 N 端直接測至 C 端，但目前只能測 60 個(gè) N 端氨基酸。 ② Cys 測定 5/一二硫代雙（ — 2— 硝基苯甲酸） DTNB ， 412nm 端基分析 ① N 端分析 DNScl 法：最常用，黃色熒光，靈敏度極高， DNS多肽水解后的 DNS氨基酸不需要提取。 用自動(dòng)序列分析儀測序 儀器原理： Edman 法，可測 60 肽。 牛胰 RNase 變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)： P164 圖 369。 通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化，親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。 糖、脂、磷酸基位置的確定 糖類通過 Asn、 Ser 與蛋白質(zhì)連接， N糖苷 0糖苷 脂類： Ser、 Thr、 Cys 磷酸： Ser、 Thr、 His 經(jīng)驗(yàn)性序列： Lys(Arg)SerAsnSer(PO4) ArgThrLeuSer(PO4) Lys(Arg) –AlaSer(PO4) 四、 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與生物功能 （一） 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)和功能 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)舉例： （ 1） 牛胰島素 Sanger 于 1953 年首次完成測序工作。 （五） 肽段的序列測定及肽鏈的拼接 Edman 法 一次水解一個(gè)Ｎ端 ３２ （ 1）耦聯(lián) PITC ＋ H２ N— ABCD?? pH8— 9 ， 40℃ PTC—— ABCD?? （ 2）裂解 PTC— ABCD?? TFA 無水三氟乙酸 ATZ— A + H2N— BCD （ 3）轉(zhuǎn)化 ATZ— A PTH— A 用 GC 或 HPLC 測定 PTHA PTC 肽：苯氨基硫甲酰肽 ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸） PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸） 耦聯(lián)：得 PTC 肽 一次循環(huán) 裂解： ATZ 轉(zhuǎn)化： 反應(yīng)產(chǎn)率 99％ 循環(huán)次數(shù) 120 (偶聯(lián)、降 98% 60 解兩步） 90% 40 DNSEdman 法 用 DNS 法測 N 末端，用 Edman 法提供（ n1）肽段。 確定肽鏈中各種 出現(xiàn)的頻率 ,便于選擇裂解方法及試劑。 （ 7） 測定各個(gè)肽段的氨基酸順序 （ 8） 確定肽段在多肽鏈中的順序。 ⑶氨基酸的 α NH2和 α COOH 縮合，只有末端及側(cè)鏈基團(tuán)有化學(xué)活性。 三級結(jié)構(gòu)： 多肽鏈通過盤旋、折疊，形成緊密的借各種次級鍵維持的球狀構(gòu)象?？垢锾m氏陽性細(xì)菌，臨床用于治療化濃性病癥。 凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且可用于定量分析。 肽中的末端 α－ COOH pK 值比游離 中的大一些，而末端 α－Ｎ ＋ Ｈ ３ 的 pK 值比游離氨基酸中的小一些， R 基變化不大。 肽鍵結(jié)構(gòu)介于１和２之間（結(jié)構(gòu) 3），是結(jié)構(gòu) 1 和結(jié)構(gòu) 2 之間的平均中間狀態(tài)。 Glu Leu His Lys pI 圖 ??? ???? rG qR ２４ 濾紙層析和薄層層析 分配原理 離子交換層析分離氨基酸 磺酸型陽離子交換樹脂 圖 樹脂先用含 Na 的緩沖液處理成鈉鹽，且 pH 在 2 左右，將氨基酸混合液（ pH23） 上柱，氨基酸此時(shí)是陽離子，與樹脂上的鈉離子交換，被固定在樹脂上。 ⑥含硫氨基酸的烷基化反應(yīng) 硫原子也是親核中心，可發(fā)生親核取代反應(yīng)。 圖 苯甲酸是食品防腐劑，在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成 N苯甲酰 Gly 后，可經(jīng)尿排出。 血紅蛋白 中 His 含量高，在血液中具很強(qiáng)的緩沖能力。為什么？ （ 2） pI 的計(jì)算（氨基酸，寡肽），等電點(diǎn)時(shí)各組分的比例分析 （ 3）不同 pH 下的組成分析和電泳行為 pH pI 時(shí)，氨基酸帶負(fù)電荷， COOH 解離成 COO，向正極移動(dòng)。 ， 50%Gly 平均凈電荷： 終點(diǎn)： 100% Gly 凈電荷： 1 第一拐點(diǎn)： pH=pK+lg[Gly177。α 氨基 pK2 在 左右，當(dāng) pH 時(shí)，α 氨基以α NH+3形式 存在。 λ （ nm） ε Tyr 275 179。 L蘇氨酸和 D蘇氨酸、 L別一蘇氨酸和 D別 蘇氨酸分別組成消旋物，而 L（ D）蘇氨酸和L（ D）別一蘇氨酸則是非對映體。 圖 P86 L蘇氨酸 D蘇氨酸 L別一蘇 D別 蘇 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬 L型（ L蘇氨酸），大部分游離氨基酸也是 L型。 Prothrombin(凝血酶原 )中含有 ?羧基谷氨酸，能結(jié)合 Ca2+。 （ 17）、 帶負(fù)電荷的 aa(酸性 aa) 2 種，在 pH6~7 時(shí)，谷氨酸和天冬氨酸的第二個(gè)羧基解離，因此，帶負(fù)電何。 Trp 有復(fù)雜的 π 共軛休系， 比 Phe 和 Tyr 更易形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。 His 含咪唑環(huán)，咪唑環(huán)的 pKa 在游離氨基酸中和在多肽鏈中不同，前者 pKa 為 ，后者為，它是 20 種氨基酸中側(cè)鏈 pKa 值最接近生理 pH 值的一種，在接近中性 pH 時(shí)，可離解平衡。 ? Cys 與結(jié)石 在細(xì) 胞外液如血液中， Cys 以胱氨酸 (Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有 Ser 殘基存在。 除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羥脯氨酸還能溶于乙醇和乙醚。 三、 氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類 1809 年發(fā)現(xiàn) Asp， 1938 年發(fā) Thr，目前已發(fā)現(xiàn) 180 多種。 １２ 三、 蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次 蛋白質(zhì)分子是由氨基酸首尾連接而成的共價(jià)多肽鏈，每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)，這種空間結(jié)構(gòu)稱為蛋白質(zhì)的（天然）構(gòu)象。 （ 6）、 功能分： 酶、運(yùn)輸?shù)鞍?、營養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、防御蛋白。膽酸與脂肪酸或其他脂類結(jié)合（膽固醇，胡蘿卜素）成鹽，乳化腸腔內(nèi)油脂，增加脂肪酶作用位點(diǎn)，便于油脂消化吸收。 a. 醇基可與脂酸成酯（棕櫚酸、硬脂酸、油酸） b. 雙鍵可加氫 （ 3）、 分布及功能 a. 70 千克人體含 140 克左右， 1/4 在腦及神經(jīng)組織中，肝、腎含量較多。通常情況下 LDL 受體功能是高度調(diào)控的，吞入相對大量的 LDL 后， LDL 受體合成就降低。當(dāng)巨噬細(xì)胞中吞食了大量脂類物質(zhì) (主要是膽固醇和膽固醇脂 )它們就成為粥樣化細(xì)胞。 血漿脂蛋白可以把脂類 (三酰甘油、磷脂、膽固醇 )從一個(gè)器官運(yùn)輸?shù)搅硪粋€(gè)器官。 （ 3）細(xì)胞分化階段可鑒定的化學(xué)標(biāo)記 可能與糖鏈的長短有關(guān) （ 4）調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生長 與正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫癌細(xì)胞有關(guān)。 神經(jīng)節(jié)苷脂的命名含有 M、 D、 T 和角注數(shù)字， M、 D、 T 分別表示含有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)唾液酸，數(shù)字表示在糖鏈上的位置。 圖 神經(jīng)酰胺 在鞘磷脂中，神經(jīng)酰胺 1 位的 OH 被磷酸膽堿 (phosphorylcholine) 或磷酸乙醇胺(phosphorylethanolamine)的磷酸基因酯化。 （ 3）、 磷脂酰絲氨酸（ PS） HO— CH2CH— COO（絲氨酸） N+H3 （ 1） — （ 3） X 均為氨基醇。 第二節(jié) 脂酰甘油 因?yàn)椴粠щ姾?，有時(shí)也稱中性脂 (neutral fats) 結(jié)構(gòu)： 圖 1 簡單三脂酰甘油 混合三脂酰甘油 第三節(jié) 磷脂 磷脂是重要的兩親物質(zhì)，它們是生物膜的重要組分、乳化劑和表面活性劑 (表面活性劑是能降低液體，通常是水的，表面張力，沿水表面擴(kuò)散的物質(zhì) )。 角注數(shù)學(xué)表明分子中雙鍵的數(shù)目， PG2 類前 列腺素是人類中最重要的前列腺素。 （不飽和鍵的多少） 100 克油脂吸收碘的克數(shù)。 必需脂肪酸 essential fatty acids 植物和細(xì)菌可以利用乙酰 CoA 合成所需的全部脂肪酸。 （ 4）衍生脂：上述脂類的水解產(chǎn)物，包括脂肪酸及其衍生物、甘油、鞘氨醇等。 （ 3）萜類和甾類及其衍生物：不含脂肪酸，都是異 戊二烯的衍生物。 脂肪酸 (主要是豆蔻酸與棕櫚酸 )可以與蛋白質(zhì)共價(jià)相連，形成脂酰蛋白 (acyloted protein)，脂?；鶊F(tuán)能促進(jìn)膜蛋白與疏水環(huán)境間的相互作用。 酸值（酸敗程度） 中和 1 克油脂中的游離脂肪酸所消耗的 KOH 毫克數(shù)。 PGE 在 C9位上有一個(gè) C=O(carbonyl group)， PGF 在 C9上有一個(gè) OH。 LTC LTD4 和 LTE4 是過敏性反應(yīng)的慢反應(yīng)物質(zhì)的組分，在炎癥反應(yīng)起積極作用，促進(jìn)白細(xì)胞趨向破壞組織。 （ 2）、 磷脂酰乙醇胺（腦磷脂）（ PE） HO— CH2CH2— N+H3（乙醇胺） 參與血液凝結(jié)。 圖 2氨基 4十八碳烯 此雙鍵還原，即二氫鞘氨醇 鞘氨醇 植物鞘氨醇 二、 神經(jīng)酰胺 鞘脂類的核心結(jié)構(gòu)是神經(jīng)酰胺（ ceramide），由鞘氨醇氨基以酰胺鍵與長鏈（ 18— 26C）脂肪酸的羥基相連。 寡糖鏈 (帶有一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基 )與神經(jīng)酰胺形成的鞘糖脂稱為神經(jīng)節(jié)苷脂，最初是從神經(jīng)組織中分離到的，在其它組織中也有分布?，F(xiàn)在臨床上正研究用酶促降解 B— 抗原或 A 抗原的末端殘基 Gal 或 GalNAc，從而增加 O— 抗原的血液來源。） 雖然脂蛋白可以指任何與脂基 (如脂肪酸、異戊二烯 )共價(jià)相連的蛋白、但它常常用來指哺乳動(dòng)物血漿 (尤其是人 )中的脂 蛋白質(zhì)復(fù)合物。 ? 脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化： (atherosclerosis) 動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)慢性病，在此過程中，粥樣物質(zhì)逐漸沉積在動(dòng)脈的內(nèi)壁上，這些沉積物稱為 Plaque(蝕斑 )，在 plaque 形成過程中，平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和各種細(xì)胞殘?jiān)饾u聚集。在正常情況下，進(jìn)入細(xì)胞中的 LDL 釋放出的膽固醇和其它脂類可用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和 代謝上的需要。 （ 1）、 結(jié)構(gòu) C3 羥基 C10和 C13各一個(gè)甲基 C5與 C6間一個(gè)雙鍵 C17異辛烷 （ 2）、 性質(zhì) 白色、斜方晶體。 三、 固醇衍生物 膽汁酸 圖 多數(shù)脊椎動(dòng)物的膽酸，能以肽鍵與 Gly 或?；撬峤Y(jié)合。 纖維狀蛋白質(zhì)：對稱性差，分子類似細(xì)棒或纖維狀。） 蛋白質(zhì)分子量 = aa 數(shù)目 *110 對于任一給定的蛋白質(zhì)，它的所有分子在氨基酸組成、順序、肽鏈長度、分子量等方面都是相同的，均一性。 （ 8）、 氨基酸是許多含 N分子的前體物 核苷酸和核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要 aa （ 9）、 一些基本氨基酸和非基本 aa是代謝中間物 精氨酸、 Citrulline(瓜氨酸 )、 Ornithine(鳥氨酸 )是尿素循不 (Urea cycle)的中間物，含氮廢物在脊椎動(dòng)物肝臟中合 成尿素是排除它們的一種重要機(jī)制。 α 氨基酸都是白色晶體，熔點(diǎn)一般在 200℃以上。 圖 33 Ser 的 CH2 OH 基（ pKa=15），在生理?xiàng)l件下不解離，但它是一個(gè)極性基團(tuán)，能與其它基團(tuán)形成氫鍵，具有重要的生理意義。 Met 的 R 中含有甲硫基（ SCH3），硫原子有親核性，易發(fā)生極化，因此， Met 是一種重要的甲基供體。（如肽聚糖的短肽間的連接） Arg 是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿， pKa 值為 ，生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。 酪氨酸的 OH 磷酸化是一個(gè)十分普遍的調(diào)控機(jī)制， Tyr 在較高 pH 值時(shí)，酚羥基離解。 酪氨酸的 OH 磷酸化是一個(gè)十分普遍的調(diào)控機(jī)制， Ser 和 Thr 的 OH 往往與糖鏈相連， Asn和 Gln 的 NH2很容易形成氫鍵，因此能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。 （二） 非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸 也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成 后，由基本氨基酸修飾而來。 四、 氨基酸