【正文】 教學(xué)難點(diǎn)：抗原抗體反應(yīng)。教學(xué)難點(diǎn)：微生物在自然界氮素循環(huán)中的作用。第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化、噬菌體感染和植物病毒的重建等三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)；遺傳物質(zhì)存在的部位和方式。教學(xué)難點(diǎn)：環(huán)境條件對(duì)微生物生長的影響。教學(xué)難點(diǎn)：微生物的代謝調(diào)節(jié)。教學(xué)重點(diǎn)：微生物的營養(yǎng)類型和培養(yǎng)基。第一節(jié) 病毒的一般特征病毒的定義；一般形態(tài)特征。第二節(jié) 真菌的繁殖真菌的繁殖方式（無性繁殖和有性繁殖）及其特點(diǎn)；各類繁殖所形成的孢子類型。第四節(jié) 放線菌放線菌的形態(tài)、基本結(jié)構(gòu)；繁殖方式；放線菌的主要類群。第六節(jié) 微生物對(duì)于人類社會(huì)發(fā)展的重要性從醫(yī)藥衛(wèi)生、食品加工、發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)，微生物在現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展中的作用等多個(gè)方面闡述微生物對(duì)于人類發(fā)展的影響，說明學(xué)習(xí)微生物學(xué)的重要性。基本概念：微生物、微生物學(xué)。學(xué)習(xí)該課程必須具備普通生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等方面的知識(shí)。（3）掌握研究微生物的基本方法和基本操作技能的理論基礎(chǔ)。置冰箱保藏。也可用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。于肉膏蛋白胨平板上再次劃線分離，使菌進(jìn)一步純化。分區(qū)劃線法劃線分離的平板分4個(gè)區(qū)，其中第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。劃線完畢，關(guān)上皿蓋。劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。若選用果園上樣，也依前法稱取土樣，制成102壤稀釋液。注意：溫度過高易將菌燙死，且皿蓋上冷凝水太多，會(huì)影響分離效果；低于45％培養(yǎng)基易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平。再從紙?zhí)兹〕鲈瓉淼囊埔汗?，插入稀釋液已搖勻的試管內(nèi)，再吹吸三次， 103的稀釋液。本次實(shí)驗(yàn)分離細(xì)菌、放線菌、霉菌時(shí)采用傾注法，酵母菌分離采用涂布法：(1)細(xì)菌的分離 1)制備土壤稀釋液 稱取土樣1 g，在火焰旁加入盛有99mL并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．振蕩10一20min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，制成102稀釋度的土壤稀釋液。[材料與用品] 選定采土地點(diǎn)舌。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時(shí)的季節(jié)、氣溫等條件而異。2．學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。〔材料用具〕，變形桿菌，枯草芽孢桿菌，產(chǎn)氣桿菌，糞水中分離的未知菌種斜面，糖發(fā)酵培養(yǎng)基；超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，試管，移液管，杜氏小管?！矊?shí)驗(yàn)原理〕各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對(duì)營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物存在差別。選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的平板。平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)過適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散形成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。10（179。〔結(jié)果分析〕描述釀酒酵母霉菌的菌落形態(tài)特征；繪圖釀酒酵母的菌體、出芽方式及細(xì)胞細(xì)節(jié)；（一）酵母的菌落濕潤，大而隆起，顏色多樣，正反面顏色一致，不透明，邊緣整齊；菌名：釀酒酵母放大倍數(shù)：100179。但制作后，其貯藏時(shí)間有一定限制，一般室溫條件下不超過三周；冰箱4℃條件下可貯藏半年，過期不能用。(三)培養(yǎng)基的分裝 用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及彈簧夾制作分裝裝置選用15179。哪些因素會(huì)影響到革蘭氏染色結(jié)果的正確？其中是關(guān)鍵的一步是什么？ 菌齡及培養(yǎng)條件和染色技術(shù)是最主要的，關(guān)鍵是脫色。10（179。10（179。A=n178。2水體中好氧細(xì)菌利用溶解氧把有機(jī)物分解為簡(jiǎn)單有機(jī)物和無機(jī)物，并用以組成自身有機(jī)體，水中溶解氧急速下降至零，此時(shí)魚類絕跡，原生動(dòng)物，輪蟲，浮游甲殼動(dòng)物死亡，厭氧細(xì)菌大量繁殖，對(duì)有機(jī)物進(jìn)行厭氧分解。通過溫和噬菌體的媒介作用，把供體細(xì)胞內(nèi)特定的基因攜帶至受體細(xì)胞中，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。原因有多因素低劑量的誘變效應(yīng)，互變異構(gòu)效應(yīng)。土壤中微生物的水平分布取決于碳源。74)偏害關(guān)系：共存于同一環(huán)境的兩種微生物，甲方對(duì)乙方有害，乙方對(duì)甲方無任何影響。69)任何兩種濃度的溶液被半滲透膜隔開，均會(huì)產(chǎn)生滲透壓。與主動(dòng)運(yùn)輸相比，有一個(gè)復(fù)雜的運(yùn)輸系統(tǒng)，被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)發(fā)生了化學(xué)變化，主要用于糖的運(yùn)輸，運(yùn)輸總效果與主動(dòng)運(yùn)輸相似，可以逆濃度梯度將營養(yǎng)物質(zhì)移向細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的物質(zhì)濃度大大超過未改變結(jié)構(gòu)的同類物質(zhì)的濃度。雜亂運(yùn)動(dòng)的，水溶性的溶質(zhì)分子（水，無機(jī)鹽，O2，CO2）通過細(xì)胞質(zhì)膜中含水的小孔從高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴(kuò)散，不與膜上的分子發(fā)生反應(yīng)，這種擴(kuò)散是非特異的，擴(kuò)散速度慢。分為不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。36）酵母菌的繁殖：有性生殖和無性生殖（芽生殖和裂殖)37）霉菌：分為腐生和寄生38）霉菌的繁殖：有性孢子和無性孢子繁殖，也可借助菌絲的片段繁殖。有性生殖和無性生殖。25）放線菌：放線菌因在固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長而得名。2用草酸銨結(jié)晶紫染色1MIN，水洗去掉浮色。（半滲透膜），含有蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和多糖。第二章12）細(xì)菌的形態(tài)：球狀，桿狀，螺旋狀和絲狀。7）類病毒：類病毒是比病毒更加小的致病感染因子。2．思考題(1)如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長曲線，你認(rèn)為會(huì)有什么不同？?jī)烧吒饔惺裁磧?yōu)缺點(diǎn)？(2)細(xì)菌生長繁殖所經(jīng)歷的四個(gè)時(shí)期中，哪個(gè)時(shí)期其代時(shí)最短？若細(xì)胞密度為103/ml，其密度高達(dá)2108/ml，計(jì)計(jì)算出其代時(shí)。4．比濁測(cè)定用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長進(jìn)行光電比濁測(cè)定。也可以直接用試管或帶有測(cè)定管的三角瓶(圖155)測(cè)定“klett units”值的光度計(jì)。2．復(fù)習(xí)光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法。再分別裝入已編好號(hào)的1至7號(hào)無菌試管中。光電比濁計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、迅速，可以連續(xù)測(cè)定，適合于自動(dòng)控制。(4)當(dāng)你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問題出在哪里?(5)用倒平板法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時(shí)間(48h)后觀察結(jié)果?三 光電比濁計(jì)數(shù)法一、目的要求1．了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。3，取樣用三支1mL無菌吸管分別吸取10105和106。2．稀釋用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，此即為10倍稀釋。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colonyforming units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告l．結(jié)果將結(jié)果記錄于下表中。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。（四）操作步驟l．菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。該?jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。4．5．病毒屬于必須在內(nèi)寄生，對(duì)不敏感，對(duì)敏感。2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525104B=50000A4．顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。（四）操作步驟l．編號(hào)取無菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明1010106。用此吸管吸取101菌液lmL，此即為100倍稀釋。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。圖15—4 比濁法測(cè)定細(xì)胞濃度的原理（三）器材1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液2．儀器或其他用具 721型分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。各種操作條件必須與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的相同，否則，測(cè)得值所換算的含菌數(shù)就不準(zhǔn)確。測(cè)定細(xì)菌的生長曲線，了解其生長繁殖規(guī)律，這對(duì)人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細(xì)菌的生長具有重要意義。圖15—6 直接用試管測(cè)OD值(四)操作步驟1．標(biāo)記取11支無菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、1116和20h。該方法準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便。沒有核糖體，沒有酶系統(tǒng)，不具備代謝能力，必須專性寄生在活的敏感宿主細(xì)胞內(nèi)。含有溫和噬菌體宿主細(xì)胞被稱作溶原細(xì)胞。15）細(xì)胞壁：細(xì)胞壁是包圍在細(xì)菌體表最外層的，堅(jiān)韌而有彈性的薄膜。合成蛋白質(zhì)20）擬核：細(xì)胞的核因沒有核膜和核仁，故稱為原始核或擬核。革蘭氏陽性菌的等電點(diǎn)低，與草酸銨結(jié)晶紫結(jié)合的牢固，對(duì)乙醇脫色抵抗力強(qiáng)，所以革蘭氏陽性菌呈紫色。31）主要的原生動(dòng)物：P71 32）微型后生動(dòng)物：原生動(dòng)物以外的多細(xì)胞動(dòng)物叫后生動(dòng)物。氧化型的酵母菌則是無發(fā)酵能力或發(fā)酵能力弱而氧化能力強(qiáng)的酵母菌。分為無機(jī)離子激活劑和有機(jī)化合物兩類。液體培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基。這一過程需要滲透酶和消耗能量。65）生長曲線：66)微生物的生存因子：微生物除了需要營養(yǎng)外，還需要環(huán)境中合適的生存因子，例如：溫度，PH，氧化還原電位，溶解氧，太陽輻射，活度與滲透壓，表面張力等。72)原始合作關(guān)系：原始合作關(guān)系是指兩種可以單獨(dú)生活的生物共存于同一環(huán)境中，相互提供營養(yǎng)及其他生活條件，雙方互為有利，相互受益。76)寄生關(guān)系：一種生物需要在另一種生物體內(nèi)生活，從中社區(qū)營養(yǎng)才得以生長繁殖，這種關(guān)系成為寄生關(guān)系。82)遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)DNA：P203 83)基因突變：基因突變即微生物的DNA被某種因素引起堿基的缺失，置換或插入，改變了基因內(nèi)部原有的堿基排列順序，從而引起其后代表現(xiàn)型的改變。雜交是通過雙親細(xì)胞的融合，使整套染色體的基因重組；或者是通過雙親細(xì)胞的溝通，使部分染色體基因重組。92)基因工程操作分5步：1先從供體細(xì)胞中選擇獲取帶有目的基因的DNA片段（基因分離）； 2將目的DNA的片段和質(zhì)粒在體外重組；（體外重組）3將重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（載體傳遞）；4重組體克隆的篩選與鑒定（復(fù)制表達(dá)）；5外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與提純（篩選，繁殖）93）天然淡水水體是人類生活和工業(yè)生產(chǎn)用水的水源，也是水生動(dòng)物和植物生長繁殖的場(chǎng)所。4隨著水體的自凈，有機(jī)物缺乏和其他原因（例如陽光照射，溫度，PH變化，毒物及生物的抗?jié)嵶饔玫龋┦辜?xì)菌死亡?！卜椒ú襟E〕：（一）油鏡的使用鏡檢裝片在中倍（或高倍鏡）下找到目的物，并使位于視野正中聚光鏡上升到最高位置，虹彩光圈開到最大，鏡頭轉(zhuǎn)開成八字形在玻片的鏡檢部位（光斑處）滴一滴香柏油油鏡轉(zhuǎn)入正下方側(cè)視小心上升載物臺(tái)（縮短鏡頭與裝片距離，鏡頭浸入油中，至油圈不擴(kuò)大為止鏡頭幾與裝片接觸）粗調(diào)器徐徐下降載物臺(tái)（密切注視視野，當(dāng)捕捉到物像時(shí)，立即用細(xì)調(diào)器校正）仔細(xì)觀察并繪圖取出裝片，清洗油鏡：擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油擦鏡紙沾少許二甲苯擦去殘留（用手指輔助，迅速拭擦一、二次）用清潔擦鏡紙仔細(xì)擦干二甲苯（23次）。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革氏染色與芽孢染色〔目的要求〕觀察細(xì)菌菌落的特征；掌握簡(jiǎn)單染色法、革蘭氏染色法的原理及操作步驟；在油鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體形態(tài)；學(xué)習(xí)環(huán)境中微生物的檢查方法，并加深對(duì)微生物分布廣泛性的認(rèn)識(shí)〔器材用具〕（18－24小時(shí)）以及菌落平板各一個(gè)；染液：草酸銨結(jié)晶紫、劃蘭氏染液、盧戈氏碘、95%的乙醇、蕃紅；無菌水、顯微鏡、載片、濾紙、液體石蠟是、擦鏡紙、接種環(huán)。5）染色反應(yīng)：紫色（陽性）圖1 視野觀察下細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)圖2 枯草芽孢桿菌芽孢形態(tài)圖〔實(shí)驗(yàn)討論〕嚴(yán)格掌握脫色程度，是成敗的關(guān)鍵。藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙報(bào)紙等。(六)斜面和平板的制作（下次試驗(yàn)完成）(七)培養(yǎng)基的無菌檢查（下次實(shí)驗(yàn)完成）(八)無菌水的制備 同時(shí)制作無菌生理鹽水，置錐形瓶中備用?！膊牧嫌镁摺翅劸平湍?、紅酵母、假絲酵母；(釀酒酵母和紅酵母菌落平板各一個(gè)。5）放大倍數(shù)：100179。（保留小數(shù)點(diǎn)后2位）長軸＝血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)次數(shù) 各中格中菌數(shù) 總菌數(shù) 稀釋倍數(shù)平均值菌數(shù)(個(gè)/mL)1短軸＝〔實(shí)驗(yàn)討論〕作業(yè)：，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺校正。同法得10－4－10－6土壤溶液用接種環(huán)沾取102土壤懸液在已經(jīng)凝固的平板表面進(jìn)行劃線分離，用無菌涂棒涂勻（多涂幾遍）。細(xì)菌的菌落為濕潤，其正反面顏色一般一致，普遍比較小。大腸桿菌不產(chǎn)生丁二醇。其進(jìn)行混合酸發(fā)酵，故甲基紅試驗(yàn)為陽性。一般在較干燥，偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線苗數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計(jì)數(shù)，分離霉菌時(shí)常在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制劑。2．培養(yǎng)基 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基(制平板和斜面，3．無菌水或無菌生理鹽水 配制生理鹽水．分裝于250mL錐形瓶中，每瓶裝99mL(或95mL分離霉