微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[最終定稿]-免費(fèi)閱讀
【正文】 四、實(shí)驗(yàn)方法微生物的純種分離（1）稀釋涂布分離法：制平板—制菌懸液—涂布—培養(yǎng)—獲得純種微生物。（稀釋用）取9ml蒸餾水于試管中，塞棉塞，包扎后滅菌。另外，培養(yǎng)基中一般含有適宜的pH值，一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。三、實(shí)驗(yàn)方法 取培養(yǎng)皿用肉眼觀察菌落的大小形態(tài)，正反面顏色、質(zhì)地、飾紋邊緣、顆粒物（閉囊殼、菌核等）。：載玻片——1滴乳酸苯酚——順一個(gè)方向鉤取少量菌絲——蓋玻片剝離飄落于乳酸苯酚——加蓋玻片——鏡檢 注意：乳酸酚不必加熱，孢囊在制片時(shí)已大多被破壞。五、作業(yè)繪出所觀察的幾種細(xì)菌和放線菌的形態(tài)并注明名稱(chēng)和放大倍數(shù)。當(dāng)用乙醇進(jìn)行脫色時(shí)，G＋細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚，類(lèi)脂含量低，乙醇脫色使肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在胞內(nèi)，經(jīng)脫色處理時(shí)，初染劑保留而呈現(xiàn)紫色。三、顯微鏡的構(gòu)造和性能（1）機(jī)械系統(tǒng)：鏡座、鏡臂、鏡筒、轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推進(jìn)器、調(diào)節(jié)螺旋。抗酸染色法（1）、正確回答抗酸染色的各個(gè)步驟（包括用加熱法或不加熱法 初染的時(shí)間）。細(xì)菌的劃線分離培養(yǎng)技術(shù)（1）、將細(xì)菌分區(qū)劃線到普通瓊脂平碟上?？己藭r(shí)間：每人限6分鐘內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃品接近火焰。2．思考題(1)如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長(zhǎng)曲線，你認(rèn)為會(huì)有什么不同？?jī)烧吒饔惺裁磧?yōu)缺點(diǎn)？(2)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所經(jīng)歷的四個(gè)時(shí)期中，哪個(gè)時(shí)期其代時(shí)最短？若細(xì)胞密度為103/ml，其密度高達(dá)2108/ml，計(jì)計(jì)算出其代時(shí)。4．比濁測(cè)定用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定。也可以直接用試管或帶有測(cè)定管的三角瓶(圖155)測(cè)定“klett units”值的光度計(jì)。2．復(fù)習(xí)光電比濁法測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法。再分別裝入已編好號(hào)的1至7號(hào)無(wú)菌試管中。光電比濁計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、迅速，可以連續(xù)測(cè)定，適合于自動(dòng)控制。(4)當(dāng)你的平板上長(zhǎng)出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問(wèn)題出在哪里?(5)用倒平板法和涂布法計(jì)數(shù)，其平板上長(zhǎng)出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(48h)后觀察結(jié)果?三 光電比濁計(jì)數(shù)法一、目的要求1．了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。3，取樣用三支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10105和106。2．稀釋用lmL無(wú)菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，此即為10倍稀釋。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colonyforming units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。（五）實(shí)驗(yàn)報(bào)告l．結(jié)果將結(jié)果記錄于下表中。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個(gè)菌體為宜。（四）操作步驟l．菌懸液制備以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。該?jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后，因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過(guò)濾法(membrane filtration)等。2．掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，則1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525104B=50000A4．顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。5．清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。（四）操作步驟l．編號(hào)取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明1010106。用此吸管吸取101菌液lmL，此即為100倍稀釋。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。圖15—4 比濁法測(cè)定細(xì)胞濃度的原理（三）器材1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液2．儀器或其他用具 721型分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無(wú)菌吸管，無(wú)菌生理鹽水等。各種操作條件必須與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的相同，否則，測(cè)得值所換算的含菌數(shù)就不準(zhǔn)確。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，了解其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，這對(duì)人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細(xì)菌的生長(zhǎng)具有重要意義。圖15—6 直接用試管測(cè)OD值(四)操作步驟1．標(biāo)記取11支無(wú)菌大試管，用記號(hào)筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時(shí)間，即0、1116和20h。該方法準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格無(wú)菌操作、防止雜菌污染。1認(rèn)真按要求完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。（2）、要
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