基因工程的酶學基礎-powerpoint演示文稿-免費閱讀
【正文】 :49:0511:49:05January 23, 2023 1意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 2023年 1月 上午 11時 49分 :49January 23, 2023 1少年十五二十時，步行奪得胡馬騎。 上午 11時 49分 5秒 上午 11時 49分 11:49: 沒有失敗，只有暫時停止成功！。 11:49:0511:49:0511:491/23/2023 11:49:05 AM 1以我獨沈久，愧君相見頻。 T7DNA聚合酶的用途： 用于對大分子量模板的延伸合成 ； （不受 DNA二級結構的影響，聚合能力較強可 延伸合成數千個核苷酸） 通過延伸或取代合成法標記 DNA3’末端 將雙鏈 DNA的 5’或 3’突出末端轉變成平末 端的結構。 合成取代法優(yōu)于缺口轉移法： 不會出現發(fā)夾結構而缺口轉移制備的探針會出現這種結構； 應用適宜的核酸內切限制酶切割，便可很容易的變成特定序列的探針。所以在限制酶消化過程產生的大小 DNA片斷都得到了同等程度的標記。 DnaseＩ：造成 DNA分子的斷裂或缺口； PolＩ ： 進行缺口轉移，使反應混合物中的 32p標記的核苷酸取代原有的未標記的核苷酸，最終從頭到尾都被標記。 DNA聚合酶Ｉ的 3’ 5’ 核酸外切酶活性 能催化 DNA鏈發(fā)生水解作用，從 DNA鏈3’ OH末端開始向 5’的方向水解 DNA，并釋放出單核苷酸分子。 共同點： 把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的 3’ OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。對 DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端 DNA分子連接，再用限制性核酸內切酶酶切，便可產生粘性末端。 ATP的用量 10μmol~1mmol/L 之間 3. 提高外源片斷與載體的濃度的比值，（ 10～ 20倍） 粘性末端 DAN片斷的連接 由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。 3. 先在 DNA片斷末端加上化學合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接 ＤＮＡ連接酶： 能夠將 DNA鏈上彼此相鄰的 3’ 羥基（ OH ）和 5’ 磷酸基團（ P），在NAD+或 ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。 2. 催化非放射性的標記物摻入到 DNA片斷的3’ 末端： 生物素等，摻入后可產生熒光染料或抗生物素蛋白結合物的接受位點。 核酸內切限制酶對 DNA的消化作用 序列發(fā)生作用。 影響核酸內切酶活性的因素： ： DNase的污染 (Mg++) ， （ 稀釋 ）， 。 BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A C CTAG G A CTAG T 雜種位點 ： GATC C （ BamHⅠ ） CTAG T（ BclⅠ ） 限制片斷的末端連接作用 分子間的連接：不同的 DNA片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。但有些同裂酶對甲基化位點的 敏感性不同。 Ⅱ 型酶的基本特性 1. 在 DNA雙鏈的特異性識別序列部位，切割 DNA分子，產生鏈的斷裂。 分子量較大，反應需 Mg++、 S腺苷酰 L甲硫氨酸（ SAM）、 ATP等。即所謂的寄主控制的限制與修飾現象簡稱（ R/M體系）。 細菌的 R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的 DNA與外來的 DNA，并能使后者降解掉。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所以在基因工程中應用不大。 2. 兩個單鏈斷裂部位在 DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的 3. 因此，斷裂的結果形成的 DNA片斷，也往往具有互補的單鏈延伸末端。 Example: 限制酶 HpaⅡ 和 MspⅠ 是一對同裂酶 (CCGG) ，當靶序列中一個 5甲基胞嘧啶時 HpaⅡ 不能進行切割，而 MspⅠ 可以。 分子內的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)形分子。 加入亞精胺提高酶的消化作用，需 適當的溫度。 DNA的局部消化 完全的酶切消化： 識別序列 n個堿基的核酸內切限制酶，對 DNA的切割能達到每隔 4n切割一次的水平。 3. 用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。 只能連接 缺口 （ nick），不能連接 裂口（ gap）。 對載體的 5’末端進行處理，用細菌的或小牛腸的 堿性磷酸酶 移去磷酸基團，使載體不能自連。 這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點 。移走粘性末端 5’ P，暴露出 5’ OH，不能產生穩(wěn)定的二聚體分子。 大腸桿菌 DNA聚合酶 DNA聚合酶Ｉ（ PolＩ）、 DNA聚合酶 ?（ Pol ? ）、 DNA聚合酶 ? （ Pol ? ）、 PolＩ和 Pol ? 的主要功能參與 DNA的合成； Pol ? 的功能同 DNA的復制有關； PolＩ同 DNA分子克隆的關系最為密切。 對酶活的影響： 反應物中缺乏 dNTPs時，大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 3’ 5’核酸外切酶活性，將會發(fā)揮作用。 dNTP 對 PolＩ酶活性的影響 在低濃度 dNTPs的條件下， PolＩ具有良好的活性 ， 提高 dNTPs濃度時， PolＩ則能夠更有效的合成 DNA。 不能夠有效的標記帶有 5’突出末端的 DNA分子。 具 EcoR1位點的 DNA分子 對 DNA分子 3‘端有控制的降解 合成作用產生選擇性標記 T4DNA聚合酶的取代合 成
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