基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)-powerpoint演示文稿-全文預(yù)覽
【正文】 3. 3’ 5’的外切酶活性（較低）。 大腸桿菌 DNA聚合酶 DNA聚合酶Ｉ（ PolＩ）、 DNA聚合酶 ?（ Pol ? ）、 DNA聚合酶 ? （ Pol ? ）、 PolＩ和 Pol ? 的主要功能參與 DNA的合成； Pol ? 的功能同 DNA的復(fù)制有關(guān)； PolＩ同 DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。 2. 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ lingase chain reaction,LCR）； 也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（ lingase amplication reaction） 3. 用寡核苷酸探針通過(guò) DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶 DNA的方法。移走粘性末端 5’ P，暴露出 5’ OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。 DNA接頭（ adapter）連接法： 1978年，美國(guó)康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞 博士發(fā)明的。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn) 。 常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法 同聚物加尾法 用 5’ 末端特異的核酸外切酶處理 DNA片斷 在 A和 B分別中加入 dATP和 dTTP 同聚物尾巴 10~40個(gè)堿基 同聚物加尾法或 T4連接酶的平末端連接法，無(wú)法用原來(lái)的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 對(duì)載體的 5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的 堿性磷酸酶 移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。 DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的 DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接 ， 對(duì)平末端的 DNA分子也可以進(jìn)行連接 ， 但連接效率較低 ， 必須加大酶的用量 。 只能連接 缺口 （ nick），不能連接 裂口（ gap）。 反轉(zhuǎn)錄酶（ reverse transcriptase） 這類酶來(lái)自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。 3. 用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。 它不需要模板，可以用含有的 3’ OHＤＮＡ片段為引物，在 3’ OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。 DNA的局部消化 完全的酶切消化： 識(shí)別序列 n個(gè)堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì) DNA的切割能達(dá)到每隔 4n切割一次的水平。 2. TrisHCl ： 維持最適的 pH值（ pH ＝ ）。 加入亞精胺提高酶的消化作用，需 適當(dāng)?shù)臏囟取? 其它字母：大寫(xiě)或小寫(xiě)，表示所來(lái)自的微生物的菌株號(hào)。 分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。 一般不能被原來(lái)的任何一種同尾酶識(shí)別。 Example: 限制酶 HpaⅡ 和 MspⅠ 是一對(duì)同裂酶 (CCGG) ，當(dāng)靶序列中一個(gè) 5甲基胞嘧啶時(shí) HpaⅡ 不能進(jìn)行切割，而 MspⅠ 可以。不易重新環(huán)化。 2. 兩個(gè)單鏈斷裂部位在 DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的 3. 因此，斷裂的結(jié)果形成的 DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。 ? 識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。 R/M體系的作用： 保護(hù)自身的 DNA不受限制； 破壞外源 DNA使之迅速降解 ? 限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門(mén)水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。 細(xì)菌的 R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的 DNA與外來(lái)的 DNA，并能使后者降解掉。基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ) 限制性核酸內(nèi)切酶 ＤＮＡ連接酶 DNA聚合酶 限制性核酸內(nèi)切酶 （ restriction endonuclease） 。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（ R/M體系）。 EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。 分子量較大，反應(yīng)需 Mg++、 S腺苷酰 L甲硫氨酸（ SAM）、 ATP等。反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。 Ⅱ 型酶的基本特性 1. 在 DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割 DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。 Pst1 EcoR1 5’ CTGCAG 3’ 5’ GAATTC 3’ 3’ GACGTC 5’ 3’ CTTAAG 5’ 平末端 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的 DNA片斷。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的 敏感性不同。 雜種位點(diǎn)（ hybrid site）：由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。 BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A C CTAG G A CTAG T 雜種位點(diǎn) ： GATC C （ BamHⅠ ） CTAG T（ BclⅠ ） 限制片斷的末端連接作用 分子間的連接：不同的 DNA片斷通過(guò)互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來(lái)。 第二、三字母：小寫(xiě)，表示所來(lái)自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。 影響核酸內(nèi)切酶活性的因素： ： DNase的污染 (Mg++) ， （ 稀釋 ）， 。 核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液 1. 氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀： 不正確的 NaCl或 Mg++濃度，會(huì)降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變。 核酸內(nèi)切限制酶對(duì) DNA的消化作用 序列發(fā)生作用。 真核生物基因組 的消化作用 小分子量的片斷 少 （電泳 容易分離目的片斷） 大分子量的片斷 多（基因文庫(kù) ） ＤＮＡ連接酶
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1