第二章基因工程工具酶-全文預(yù)覽
【正文】 ,（一）DNA連接酶的概念與作用機(jī)制 （二） 連接酶種類及特性的比較 （三） DNA連接酶作用的特點 （四） DNA連接酶的反應(yīng)條件 （五）影響連接反應(yīng)的因素DNA連接的策略 （六）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和 載體連接的一般方案,二、 DNA連接酶及其應(yīng)用,DNA重組的核心技術(shù)：DNA片段之間的體外連接 ——連接酶。巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性) BSA（牛血清白蛋白）穩(wěn)定酶蛋白。 解決辦法：擴(kuò)大反應(yīng)體積 20?L—50?L 延長酶作用時間 1h—數(shù)小時 增加酶用量 1u—10u,?,（3）DNA甲基化程度 甲基化程度高不被大多數(shù)限制性內(nèi)切酶切割，解決辦法是： 選用無甲基化酶的突變菌株； 使用對甲基化酶堿基無切割能力的酶（對哺乳動物DNA）。,?,星號活力的產(chǎn)生可為酶提供新的序列特異性，這些活性在某些情況下可能是有用的，但是很少導(dǎo)致第二識別位點的完全或同等的切割，因此為了避免星活力的出現(xiàn)，所有限制性酶切反應(yīng)均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下，通常反應(yīng)條件通過緩沖液控制。,?,酶活單位 一個限制酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37℃）下，1h內(nèi)中完全降解1 ?g ? DNA所需要的酶量。但轉(zhuǎn)化后不能再用這兩種酶鑒定。 在A情況下產(chǎn)生的重組體只能被一種酶消化，減少了可逆反應(yīng)，提高了重組率。,?,平齊末端,帶5’－P端的黏性末端,帶3’－OH 和5’－P端的平末端,例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，識別順序都是 5’……C|CG G……3’ 3’……G GC|C……5’ 如果其中有5’甲基胞嘧啶，HpaⅡ不能夠切割，MspI能切割。 同裂酶 isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切酶。,能識別外源DNA并將其水解的內(nèi)切核酸酶，是細(xì)菌對外源DNA的防御機(jī)制。,?,（二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性,特性 1. 限制修飾活性 2. 內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu) 3. 限制輔助因子 4. 切割位點 5. 特異性切割 6. 基因克隆中,I 型 雙功能的酶 3種不同亞基 ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸 距特異性位點5‘端至少1000bp 不是（隨機(jī)） 無用,II 型 限制酶和修飾酶分開 單一成分 Mg2+ 位于識別位點上 是 非常有用,III 型 雙功能酶 2種亞基 ATP、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸 特異性位點3‘端2426bp處 是 用處不大,?,（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名,寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個斜體 字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為 Hin； 用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind； 如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則 用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如Eco R I、 Hind III。,?,從此，相關(guān)研究展開。1968年發(fā)現(xiàn)Ⅰ型內(nèi)切酶。第二章 基因工程工具酶,分類： 限制性內(nèi)切酶（Restriction Endonuclease） RNaseA 1.水解酶類 核酸酶 RNaseT1 RNaseH DNase Ⅰ S1 核酸外切酶（Exonuclease）,?,大腸桿菌DNA聚合酶 （DNA PolⅠ ) 大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow Fragment|） 2.DNA聚合酶類 嗜熱DNA聚合酶（Taq酶 ） DNA連接酶 ( Ligase ) 反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase),小牛腸堿性磷酸酶(CIP) 3.修飾酶類 細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP ) T4噬菌體多核苷酸激酶 （T4 Phage Polynucleotide Kinase),鼠源 禽源,?,（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) （二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類 （三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名 （四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 （五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)條件,一、 限制性核酸內(nèi)切酶,?,由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象20世紀(jì)60年代，Linn和Arber 發(fā)現(xiàn),?(B),?(K),大腸桿菌B,大腸桿菌K,EOP=1,EOP=1,EOP=10 4,EOP=10 4,EOP 成斑率 efficiency of plating,外源DNA,自身DNA,（一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),限制和修飾現(xiàn)象,?,限制—修飾的酶學(xué)系統(tǒng),?(B),?(B),酶切位點 不被修飾,噬菌體DNA 被切割,酶切位點 被修飾,基因組DNA 不被切割,?,E.coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，
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