基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)-powerpoint演示文稿(文件)
【正文】 ，形成 3’ OH 和 5’ OH 的缺口。銜接物是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。 雙銜接物： 可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。 粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。 樣品 DNA、探針 (4) 94度變性 DNA聚合酶 常用的 DNA聚合酶： 大腸桿菌 DNA聚合酶、 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 Klenow大片斷酶、 T4DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶、 反轉(zhuǎn)錄酶等。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為 109?1000dal。 DNA聚合酶Ｉ 5’ 3’的核酸外切酶活性 5’ 3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上； 切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距 5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生； DNA的合成可以增強(qiáng) 5’ 3’的核酸外切酶活性； 5’ 3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及 3’ 5’的水解作用位點(diǎn)是分開的。 DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途： 通過 DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針。在 25μl 總體積中含有 1 μg 純化的特定 DNA片斷，并加入適量的 DnaseＩ、 PolＩ、 α 32pdNTPs和未標(biāo)記的 dNTPs。 Klenow片斷與 DNA末端標(biāo)記 Klenow片斷：是由大腸桿菌 DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為 76?1000dal的大片斷分子。因?yàn)楸粯?biāo)記的 DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關(guān)。具有 5’ 3’的聚合酶活性和 3’ 5’ 的外切酶活性。 在反應(yīng)過程中，通過 T4 DNA聚合作用，反應(yīng)物中的 α 32pdNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的 DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。 合成 cDNA的主要步驟： 應(yīng)用 poly(A)mRNA為模板，以 12~18個(gè)堿基長(zhǎng)的 oligo(dT)片斷作為引物，加入反轉(zhuǎn)錄酶，合成出 cDNA第一鏈 。 具有 5’ 3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的 3’ 5’核酸外切酶活性。 用途： 作為一種 DNA序列分析的工具酶： 加工性能高；無 3’ 5’的外切酶活性； 具有催化脫氧核糖類似物聚合的能力。 , January 23, 2023 雨中黃葉樹，燈下白頭人。 :49:0511:49:05January 23, 2023 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 2023年 1月 23日星期一 11時(shí) 49分 5秒 11:49:0523 January 2023 1做前，能夠環(huán)視四周；做時(shí)，你只能或者最好沿著以腳為起點(diǎn)的射線向前。 :49:0511:49Jan2323Jan23 1世間成事，不求其絕對(duì)圓滿，留一份不足，可得無限完美。 。 , January 23, 2023 閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。 2023年 1月 23日星期一 11時(shí) 49分 5秒 11:49:0523 January 2023 1一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。 2023年 1月 23日星期一 上午 11時(shí) 49分 5秒 11:49: 1最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。 :49:0511:49Jan2323Jan23 1越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 2023年 1月 23日星期一 11時(shí) 49分 5秒 11:49:0523 January 2023 1空山新雨后，天氣晚來秋。 :49:0511:49:05January 23, 2023 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 , January 23, 2023 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 。 :49:0511:49Jan2323Jan23 1故人江海別，幾度隔山川。 有效的填補(bǔ)和標(biāo)記具有 5’突出末端 的 DNA片斷的 3’ 末端。 修飾的 T7DNA聚合酶 對(duì)天然的 T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之完全失去 3’ 5’的外切酶活性。 通過同聚物或合成的銜接物，使 DNA分子克隆到適當(dāng)?shù)妮d體分子上。 具 EcoR1位點(diǎn)的 DNA分子 對(duì) DNA分子 3‘端有控制的降解 合成作用產(chǎn)生選擇性標(biāo)記 T4DNA聚合酶的取代合 成法標(biāo)記 DNA斷末端及 制備鏈的特異探針 反轉(zhuǎn)錄酶： 具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和 RNaseH活性。作用于雙鏈 DNA片斷，并按 3’ 5’的方向從 3’ OH末端開始降解 DNA。 不能夠有效的標(biāo)記帶有 5’突出末端的 DNA分子。 Klenow片斷的主要用途： 修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的 DNA所形成的 3’隱蔽末端； 標(biāo)記 DNA片斷的末端； cDNA克隆的第二鏈 cDNA的合成； DNA序列的測(cè)定。 dNTP 對(duì) PolＩ酶活性的影響 在低濃度 dNTPs的條件下， PolＩ具有良好的活性 ， 提高 dNTPs濃度時(shí)， PolＩ則能夠更有效的合成 DNA。當(dāng)外切酶活性從缺口的 5’一側(cè)移去一個(gè) 5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的 3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polＩ不能在 3’ OH和 5’ P之間形成一個(gè)鍵，隨著 5’一側(cè)的核苷酸不斷移去， 3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著 DNA分子合成的方向移動(dòng)。 對(duì)酶活的影響： 反應(yīng)物中缺乏 dNTPs時(shí)，大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 3’ 5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。 DNA聚合酶Ｉ的酶活性： 1. 5’ 3’的聚合酶活性； 2. 5’ 3’的外切酶活性；
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1