分子生物學(xué)基本技術(shù)—pcr(polymerasechainreaction)-免費閱讀
【正文】 可找出與靶基因連鎖的 RAPD標(biāo)記，進行基因定位。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測 PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的 DNA擴增檢測。 ?延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。 ? Taq DNA polymerase（ Taq DNA 聚合酶）： 濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。不用時應(yīng) 20℃ 保存。首先待擴增 DNA 模板加熱 變性 解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生 退火 ，再將溫度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以 延伸 。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 10．解鏈溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) [ =20 nt ] Tm = +*(GC%)600/L [ 20nt] Tm一般５５ ℃ ～８０ ℃ ［５５ ℃ ～５８ ℃ 最佳］ PCR反應(yīng)中結(jié)合溫度（ anneaning temperature） T = Tm 5℃ ?P+、 P的設(shè)計方法 四、 PCR反應(yīng)體系 標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)體系： 10擴增緩沖液 10ul 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物 各 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加雙或三蒸水至 100ul ? Template（模板）： ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA模板核酸的量與純化程度，是 PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 ? Mg2+ ： for Taq polymerase activity Mg2+對 PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR反應(yīng)中，各種 dNTP濃度為 200umol/L時， Mg2+濃度為 ～ 。 Taq DNA聚合酶 酶活性(%) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 五、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化（ PCR optimization) 變性溫度和時間 ? 一般情況下， 92℃ ～ 95℃ l5min足以使模板 DNA變性，若低于93℃ 則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值 (解鏈溫度 )=4(G+C)＋ 2(A+T) 復(fù)性溫度 =Tm值 (5～ 10℃ ) 延伸溫度和時間 ?溫度 ： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ ，高于 90℃ 時， DNA合成幾乎不能進行 ?Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性 ： 70～ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 ?時間 ：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。 ? ： PCR產(chǎn)物的生成量以指數(shù)方式增加 ? 、快速： PCR反應(yīng)一般在 2～ 4 小時完成擴增反應(yīng)。 ? 酶切分析 根據(jù) PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶
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