血紅蛋白的提取和分離(第1課時(shí))-免費(fèi)閱讀
【正文】 首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到 血紅蛋白溶液， 即 :樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后 通過(guò)凝膠色譜法 將相對(duì)分子質(zhì)量較大的 雜質(zhì)蛋白除去， 即 :樣品的純化；最后經(jīng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 進(jìn)行純度鑒定。 ： ：（略） 收集得到的純化后的蛋白 觀察你處理的血液樣品離心后 是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖 518）， 如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。 ⑤收集： 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每 5ml收集一試管，連續(xù)收集 。 裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在： 因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果 。 ⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。 ③分離： 用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的 紅色透明液體。 (1)紅細(xì)胞的洗滌 : ① 洗滌目的 : 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的 分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。 ： SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性 。 ： ① 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解離的基團(tuán) ，在一定的 pH下，這些基團(tuán)會(huì) 帶上正電或負(fù)電 。 一、血紅蛋白的提取和分離 一、基礎(chǔ)知識(shí) （一）凝膠色譜法（分配色譜法） 根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。 凝膠是一些 微小 的 多孔 球體，由 多糖類化合物 （如葡聚糖、瓊脂糖等）構(gòu)成。 ② 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其 所帶電荷相反 的電極移動(dòng)。 由幾條肽鏈組成的 蛋白質(zhì)復(fù)合體 在 SDS的作用下會(huì) 解聚成單條肽鏈 ，因此測(cè)定的結(jié)果只是 單條肽鏈的分子量 。 ② 洗滌操作： 采集血樣。 (4)透析： (粗分離 ) ①過(guò)程： 取 1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有 300ml的物質(zhì)的量濃度為 20mmol/l的磷酸緩沖液 中（ pH為 ），透析 12小時(shí) 。 （ 2）凝膠色譜柱的裝填 ① 凝膠的選擇： A、材料： 交聯(lián)葡聚糖凝膠（ G75）。 ④ 洗滌平衡： 裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用 300ml的 20mmol/l的 磷酸緩沖液（ pH為 ） 充分洗滌平衡 12小時(shí)。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功） ⑥ 注意： 正確的加樣操作： 不要觸及并破壞凝膠面。 此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響
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