【正文】 在 20 ℃，78％膠原蛋白在提取的前 36 小時溶解，然后溶解變緩慢，在 30 ℃，70％左右膠原蛋白在提取的前 12 小時溶解，然后溶解變緩慢。在20 ℃，65％膠原蛋白在提取的前 36 小時溶解，然后溶解變緩慢，在 30 ℃，75％左右膠原蛋白在提取的前 12 小時溶解，然后溶解變緩慢。說明在此條件下，膠原蛋白之間發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，生成了胃蛋白酶也無法剪切的交聯(lián)鍵，導(dǎo)致膠原蛋白無法溶解。在 20 ℃條件下，含 %、1%、2%、3%過氧化氫的 mol/L 氫氧化鈉溶液中，魚皮形態(tài)保持原狀，黑色素逐漸褪去，脫色的速率無差別，最終少數(shù)魚皮上有黑色素殘留。Highmolecularweight markers(Sigma，USA)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。 SDSPAGE 電泳分析參考 Laemmli [78]SDS(十二烷基硫酸鈉)聚丙稀酰胺凝膠電泳方法分析膠原蛋白樣品。使用前，將溶液 A 和 B 以 50：1 相混合。液體樣品水解處理：取液體樣品 1 mL 加 6 mol/L 的硫酸，在 110 ℃條件下水解16 個小時，水解液全部轉(zhuǎn)移至 50 mL 燒杯中，用 6 mol/L 和 1 mol/L 的氫氧化鈉調(diào)pH 至 。脫色處理 2：取一定量的魚皮，加入含 1％雙氧水 mol/L 氫氧化鈉在 20 ℃小時處理 24 小時，用食物攪拌機(jī)(Philips，HR2964)高速均質(zhì) 2 分鐘，然后雙層紗布過濾，再用 10％正丁醇清洗魚皮 3 次，再用自來水清洗魚皮并涼干。本章研究了氫氧化鈉和雙氧水不同工藝參數(shù)的脫色、脫雜蛋白、脫脂肪的效果，以及其對膠原蛋白的溶解性的影響。最后，在酸性－中性溶液中分級鹽析純化草魚皮和豬皮的膠原蛋白，對比研究了草魚皮和豬皮的膠原蛋白的肽鏈組成。明膠還可用于制作蛋糕和各種糖衣，由于明膠的穩(wěn)定性，即使在熱天，當(dāng)液相增加時，這種糖衣也不致滲入糕餅中，而且還能控制糖晶體的大小。 食品包裝材料膠原蛋白是制作人工腸衣的理想原料，在熱處理過程中，隨著水分和油脂的蒸發(fā)和熔化，膠原幾乎與肉食的收縮率一致，膠原蛋白可作為食品黏合劑制成纖維膜，用做香腸腸衣、肉類、魚類的包裝紙；用明膠制成的明膠膜又稱可食包裝膜；生物降解膜，具有良好的抗拉強(qiáng)度、熱封性、較高的阻氣、阻油、阻濕性能。有研究表明，鋁對人體有害，老年癡呆癥可能與攝入過量的鋁有關(guān)，而膠原蛋白在排出體內(nèi)的鋁方面也具有獨到之處 [60]。膠原具有適用于食品的一些屬性：食用級膠原通常外觀為白色，口感柔和，味道清淡，易消化。必須指出的是與明膠類似，所提取的膠原的等電點也降低，這是因為在提取過程中，天冬酰胺和谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼岷凸劝彼帷Ｕ{(diào)變提取溫度、振蕩速率以及對組織的溶劑體積比，可以提取有交聯(lián)度膠原，但不可避免地會改變所提取膠原的組成，提取的膠原再經(jīng)過離心、沉降、透析即可得純化膠原。三螺旋特殊結(jié)構(gòu)存在，使得三螺旋區(qū)域高抗蛋白水解酶（如胃蛋白酶）的攻擊，所以用蛋白酶提取膠原蛋白時，膠原蛋白的三螺旋結(jié)草魚皮膠原蛋白的制備及性質(zhì)研究4構(gòu)保持完整，僅切除了末端的端肽，膠原酶是唯一能夠攻擊螺旋酶區(qū)域的酶 [4345]。羥脯氨酸起源于脯氨酸被羥化酶遺傳翻譯后的羥基化作用。表 11 膠原蛋白的主要類型及分布Table11 Major types and distribution of collagens類型 肽鏈組成 分子式 組織中分布Ⅰ α1(I), α2(I) [α1(I)]2α2(I)[α1(I)]3 廣泛分布：皮膚，骨，腱，韌帶，角膜，等Ⅱ α1(II) [α1(II)]3 軟骨，玻璃體Ⅲ α1(III) [α1(III)]3 皮膚，血管壁，腸，子宮壁Ⅳα1(IV), α2(IV),α3(IV), α4(IV),α5(IV), α6(IV)[α1(IV)]2α2(IV)。膠原小分子多肽，具有抗氧化延緩衰老等作用，它是采用復(fù)合酶將膠原蛋白剪切成分子量只有幾百或幾千左右的膠原多肽。市面上部分膠原蛋白產(chǎn)品其所含的“膠原蛋白”，應(yīng)該叫做明膠，英文學(xué)名叫Gelatin。C ,triple helix structure keep intact with a plete biological activity. 4. Acidsoluble and pepsinsoluble collagens (ASC and PSC) were extracted from the skin of grass carp and partially characterized. the UV spectra of ASC and PSC from grass carp showed that the distinct absorption was obtained near 223 nm。關(guān)鍵詞：膠原蛋白；草魚皮；性質(zhì)；Ⅰ型膠原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白摘 要IIIRESEARCH ON PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF COLLAGEN FROM SKIN OF GRASS CARP ABSTRACTIn this paper, we study grass carp skin pretreatment conditions, using the method of sodium hydroxide adding hydrogen peroxide can bleaching and removing noncollagen and defatted to grass carp skin, the role of its collagen solubility effects. Effects of the key parameter extraction —temperature to the collagen extraction rate and characterization, Characterization different between Acidsoluble collagen and enzymesoluble collagen。3．溫度和是否加酶對膠原蛋白提取率影響很大。本人授權(quán)　　 　 　 大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或組織已經(jīng)發(fā)表或公布過的研究成果，也不包含我為獲得 及其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或?qū)W歷而使用過的材料。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。保密□，在 年解密后適用本授權(quán)書。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。2．在含 1％雙氧水不同濃度氫氧化鈉處理魚皮以后，對魚皮膠原蛋白性質(zhì)產(chǎn)生了影響。表明草魚皮膠原蛋白在功能食品、醫(yī)藥、化妝品、制藥等方面有潛在的應(yīng)用。C, 1% hydrogen peroxide, sodium hydroxide concentration solution, leaching treatment 24 hours later, have great impact on the Characterizations of collagen, even in the acid+ enzyme xtracted 48 hours, Extraction rate only 8%. In the conditions of mol/L NaOH or 4 ℃ for 草魚皮膠原蛋白的制備及性質(zhì)研究IVdealing with collagen, have less impact on the collagen extraction rate, so it can only choose lower concentrations of sodium hydroxide or low temperature skin. 3. Key parameter temperature of extraction of collagen and pepsin have great impact on the extraction rate. At 4 ℃ in the acetic acid + pepsin solution extraction rate more than double extraction rate in acetic acid, At 20 ℃ and 30 ℃, the extraction rate of solution containing pepsin is far higher than that of acetic acid. The higher the temperature, the higher collagen extraction rate. However, SDSPAGE showed that peptide chain of collagen extracted at 30 176。 type III collagen 第一章 文獻(xiàn)綜述1第一章 文獻(xiàn)綜述1 膠原蛋白的概念膠原蛋白，英文學(xué)名叫 Collagen，是一種纖維蛋白，分子量約為 300kda，它是動物體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最特殊者，它以三股螺旋體結(jié)構(gòu)聚合而成的膠原纖維存在于脊椎動物體結(jié)締組織中，扮演結(jié)合組織、連結(jié)器官的重要角色。市場價格和膠原蛋白相差甚遠(yuǎn)。不同的膠原蛋白類型在組織內(nèi)的分布表明了其顯著的多樣性和范圍。膠原蛋白的微纖維結(jié)構(gòu)如圖 11 所示：第一章 文獻(xiàn)綜述3圖 11Ⅰ膠原蛋白的結(jié)構(gòu)Figure11 Structure of typeⅠcollagen在Ⅰ型膠原蛋白一級結(jié)構(gòu)中，每條鏈含有超過 1000 個氨基酸，氨基酸以獨特的三螺旋排列，甘氨酸它在序列每第三個位置出現(xiàn)，在緊密的三螺旋鏈中間留下很小的空間給殘基 [2224]，在重復(fù)的 GlyXY 單元的非甘氨酸位置中，大約 35%位置被脯氨酸代替，幾乎全部在 X 位置，而 4羥脯氨酸主要在 Y 位置 [2527]。三級結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是原膠原蛋白的基本單位 [3941]。如使皮膚富有彈性。堿法：利用強(qiáng)堿和強(qiáng)堿鹽溶液(如 10%的氫氧化鈉和 10%硫酸鈉)可以將結(jié)締組織中不溶性膠原溶解出來，與不溶性膠原結(jié)合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，膠原纖維瓦解，最終所得膠原的大小和分子質(zhì)量，取決于處理時間以及堿的濃度。一般提取的條件：胃蛋白酶和組織干重比為1：10， mol/L 醋酸溶液。 功能性食品和保健品經(jīng)常食用含膠原蛋白豐富的食品，能有效地增加皮膚組織細(xì)胞的儲水能力，增強(qiáng)和維持肌膚良好的彈性，強(qiáng)化肌膚的韌性，延緩肌體的衰老 [5658]。 肉制品改良劑研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白可以影響肉類的嫩度和肉類蒸煮后肌肉的紋理，其含量和存在狀態(tài)與肉制品的嫩度密切相關(guān) [50，6163] ：通過破壞膠原蛋白分子內(nèi)的氫鍵，使其原有的緊密超螺旋結(jié)構(gòu)破壞，形成分子較小、結(jié)構(gòu)較為松散的明膠，即可改善結(jié)締組織的嫩度，提高其食用價值，研究表明：將酸法制得的膠原蛋白粉添加到肉制品中，不僅能改善產(chǎn)品品質(zhì)，如口感好、多汁，提高產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，而且無不良?xì)馕丁＠媚z原的成膜性，可將其用作固化酶的膜材料和肉食品標(biāo)簽，后者已經(jīng)在歐洲實際應(yīng)用。本工藝比傳統(tǒng)工藝縮短了工藝步驟。食品中最終不得殘留。 預(yù)處理對膠原蛋白的溶解性的影響取 2 g 魚皮，加入 200 mL 處理液，再加入 2 mL 過氧化氫溶液，處理 24 小時，如下表 21，用雙層紗布過濾處理液，再用蒸餾水清洗 3 次，然后在 20 ℃條件下，加入 300 mL mol/L 醋酸，再加 g 胃蛋白酶，提取 48 小時，在12348 小時分別取 5 mL 提取液，用 500 目的膜過濾兩次后，測定羥脯草魚皮膠原蛋白的制備及性質(zhì)研究10氨酸含量。標(biāo)準(zhǔn)工作液 5 μg/mL：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液 mL 于 500 mL 容量瓶中，定容。 福林酚法測定蛋白質(zhì)含量試劑：牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（250 μg/mL）：精確稱取 g 牛血清蛋白，定容至 100 mL 福林酚試劑甲溶液 A：10 g Na2CO3，2g NaOH， g 酒石酸鉀鈉，用蒸餾水溶解后定容至500 mL。標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度梯度：取 0 mL， mL， mL， mL， mL， mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，分別加入對應(yīng)量蒸餾水，使最終體積為 1 mL。90℃加熱變性 5 分鐘冷卻備用。氫氧化鈉濃度從 mol/L－ mol/L，脫色速度越來越快，脫色反應(yīng)越來越強(qiáng)烈。0%2%4%6%8%10%0% 1% 2% 3% 4%過 氧 化 氫 濃 度 (％ )蛋白質(zhì)溶解率(％)圖 26 在含不同濃度 H2O2的氫氧化鈉溶液（ mol/L）中蛋白質(zhì)溶解率Figure26 Dissolve rate of protein in mol/L NaOH with different H2O2 concentration圖 26 顯示了不同濃度氫氧化鈉的脫色素效果：在 20 ℃條件下，含%、1%、2%、3%過氧化氫的 mol/L 氫氧化鈉溶液中，蛋白質(zhì)的溶解率都在%左右，說明過氧化氫的濃度，對蛋白質(zhì)的溶解率幾乎沒有影響。在相同的時間里，20 ℃溶解了 80％左右，30 ℃溶解了 87％左右。在 4 ℃，醋酸＋胃蛋白酶溶液中提取率是醋酸溶液提取率的兩倍多，在 20 ℃和 30 ℃，加