【正文】 它們是一類分子量很大的物質(zhì) ， 所以可以利用凝膠層析的排阻效應將這些大分子熱源物質(zhì)與其它相對分子量較小的物質(zhì)分開 。 在同樣的條件下將未知分子量的待測樣品進行上述凝膠層析 ， 得到它的洗脫體積 ，用該體積在標準曲線上查得未知樣品的相對分子質(zhì)量的對數(shù)值 ， 從而進一步計算出該未知樣品的相對分子質(zhì)量 。 使用非常的廣泛 、 普遍 。洗脫速度慢是一柄雙刃劍，它既可以使一些樣品在兩相中有充分的時間平衡，分離效果好，又可能造成樣品擴散加劇、區(qū)帶變寬，反而會降低分辨率，而且實驗時間會大大延長。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越小，分辨率越高。首先要將凝膠進行洗滌，以除去凝膠表面的污染物，然后將凝膠放在濃度由低到高的乙醇中逐級脫水（ 30%、 50%、 70%、 80%、 95%、無水乙醇），最后是乙醚，脫水后的凝膠在室溫下晾干，或置于 60 C烘箱中烘干，將乙醚揮發(fā)干，即可裝瓶保存。溶脹處理后，要對凝膠進行反復漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的粒度過小的凝膠。粒度小，外水體積也小，裝柱易均勻，層析時渦旋擴散影響小，分辨率高，但流速慢；粒度大，外水體積也大，裝柱不易均勻，層析時渦旋擴散影響較大，分辨率低，但流速快。 凝膠層析操作的具體問題 1. 凝膠的選擇 選擇凝膠時，首先要確定是組分分離還是組別分離。多孔硅膠和多孔玻璃珠都屬于硬質(zhì)無機凝膠。瓊脂糖凝膠對樣品的吸附作用很小，排阻極限卻很大，分離范圍更廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。瓊脂由中性鏈狀的瓊脂糖和帶負電荷的含磺酸基和羧基的瓊脂膠兩部分組成。最常用的聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)是由 BioRad Laboratories生產(chǎn)的商品名為 BioGel P的系列產(chǎn)品，主要型號有 BioGel P2 ? BioGel P300等 10種，后面的數(shù)字 103基本代表它們的排阻極限，排阻極限最大的 BioGel P300為3?105。而以 LH型葡聚糖凝膠（經(jīng)乙醇或二甲亞砜甲酰胺或 N、 N二甲基甲酰胺等有機溶劑溶脹）作為固定相，以有機溶劑為流動相，對脂溶性物質(zhì)進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠滲透層析。 Sephadex G由于含有羥基基團，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團（尤其是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。 排阻極限是指不能進入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。 Sephadex G的主要型號是 G10 ? G200，型號不同，交聯(lián)度也不同，分離相對分子質(zhì)量的范圍就不同，這就是所謂的分級分離。另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等等。它具有設(shè)備簡單、操作方便、重復性好、樣品回收率高、條件溫和，特別是不改變樣品生物學活性等優(yōu)點。 凝膠層析 凝膠層析是 20世紀 60年代發(fā)展起來的一種簡便有效的生物化學分離分析方法，又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析等。然后將收集的每管溶液進行濃度或活性測定。 由于影響柱層析效果的因素很多，洗脫條件的選擇就尤為重要。 ⑸ 洗脫 洗脫的方式可分為簡單洗脫 、 分步洗脫和梯度洗脫三種 。 一般講 ，加樣量盡量少些 ， 分離效果比較好 。 層析柱的填充是先關(guān)閉出水口，用溶劑灌注至1/3柱高，并使篩板下的“死體積”不存有氣泡，再將處理好的填充材料緩慢地倒入柱中，以防止氣泡存留在柱內(nèi)，靜置使其沉降，并放出過多的溶劑，為了避免分層，最好一次裝完，如需分幾次填充，則在二次填充前應先在已經(jīng)沉淀的表面用玻棒攪拌后再傾注，重復這個過程，直至裝到需要的高度。 一般柱長度不超過 100cm， 為得到高分辨率 ， 可以將柱子串聯(lián)使用 。部分收集器收集柱子流出液的裝置 ， 它使每一管按預定的時間或滴數(shù)收集流出液 ， 然后自動移位 ， 下一管再繼續(xù)收集 ， 把整個流出液劃分成許多個部分 。 離子交換層析是以離子交換劑為固定相 ， 根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進行分離的一種層析技術(shù) 。 2. 根據(jù)流動相的形式分類 ， 層析可以分為液相層析 、 氣相層析和超臨界層析 。 12. 死時間 （ t0） 及死體積 （ V0） 流動相中的溶質(zhì)進入層析柱后 ， 不被固定相所吸附 ， 與固定相不發(fā)生任何作用 ， 通過柱所需要的時間 ， 稱為死時間 （ t0） ；通過柱所收集的體積 ， 稱為死體積 （ V0） 。 柱床體積 Vt可以通過加入一定量的水至層析柱預定標記處 ， 然后測量水的體積來測定 。 一般來說 ，反相色譜 （ 或反相柱 ） 用于分離純化極性小的有機分子 （ 有機酸 、 醇 、 酚等 ） 。一般而言，Rs ，Rs=。不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的 。 3. 分配系數(shù)及遷移率 （ 或比移值 ） ： 分配系數(shù)是指：在一定的條件下 ， 某一組分在固定相和流動相中含量 （ 濃度 ） 的比值 ， 常用 K來表示 。那么，流動相把組分交給固定相速度，固定相把組分交給流動相的速度，以及各組分在固定相和流動相中達到平衡的速度都是影響層析的因素，這就是傳質(zhì)阻力。由此可見，渦旋流現(xiàn)象的發(fā)生是由于固定相的顆粒大小不均勻及填充柱的不均勻引起各組分在層析柱中所發(fā)生的位移不同。 但是塔板理論采用的是平衡過程的研究方法 ， 忽略了許多動力學因素對柱分離效率的影響 。 2. 每個塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動相之間瞬間達到平衡 ， 且忽略分子縱向擴散 。 （ 1） 塔板理論 層析分離技術(shù)的目的是要將混合樣品中各組分彼此分開，它遵循相似相溶的原理，在互不相溶的兩相（固定相和流動相）之間進行分配。 但是，當時這種方法并沒引起人們太多的關(guān)注，直到 1931年 R. Kuhn用此法從蛋黃中分離出黃體素、從玉米中分離出玉米黃色素開始，層析技術(shù)才逐漸引起了人們的重視。 他向填充有 CaCO3粉末的柱內(nèi)加入植物色素提取液 ， 并以石油醚淋洗 ， 由于 CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同 ， 色素被逐漸分開 ，柱上端呈黃色 ， 較下端呈綠色 ， 出現(xiàn)了不同顏色的譜帶 ?，F(xiàn)在它們已成為生物化學與分子生物學、化學等領(lǐng)域不可缺少的分析分離手段。 對于一個層析柱來說 ， 可作如下基本假設(shè)： 1. 層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的 ， 而且層析柱由若干層組成 。 則理論塔板數(shù)量 n為： L/H （ 2） 速率理論 根據(jù)上述假設(shè) ， 塔板理論初步闡明了組分在層析中的遷移速度 。由上式可以看出，當流動相流速一定時， A、 B、 C越小， H也越小，理論塔板數(shù)越大，柱效就越高。分子擴散對于氣相色譜和液相色譜的影響大相徑庭，由于組分在液體中比氣體中的擴散要小 105倍，它對液相色譜的影響可以忽略。 它可以是固體物質(zhì) （ 如吸附劑 ， 凝膠 ， 離子交換劑等 ） ， 也可以是液體物質(zhì) （ 如固定在纖維素或硅膠上的溶液 ） ， 這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附 ， 溶解 ， 交換等作用 。 相對遷移率是指：在一定條件下 ， 在相同時間內(nèi) ， 某一組分在固定相中移動的距離與某一標準物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值 。圖是計算分辨率的示意圖。 5. 正相色譜與反相色譜 正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性 ，因此 ， 在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快 ， 先從柱中流出來 。 7. 床體積 （ Vt） 通常床體積是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積 （ Vt） 。 因為它的分子量大（ 為 200萬 ） ， 在各種型號的凝膠中都被完全排阻 ， 并且它呈藍色 ， 易于觀察和檢測 。 柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形 ， 在柱中進行層析 。 吸附層析是以吸附劑為固定相 ， 根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術(shù) 。 溶劑池主要用于儲存樣品和作為流動相溶液或溶劑的儲存器 。如果在 A瓶和 B瓶中注入的是不同的pH或極性的溶液，同樣也可以得到類似于上述的三種梯度類型。 在填充層析柱之前，對所要填充的材料需作一些預處理。平衡液體積一般為 2~3倍柱床體積，以保證平衡后柱子符合填充均勻、松緊一致和沒有氣泡的標準。 應注意的是： ①樣品溶液不能有沉淀出現(xiàn)，否則應過濾后再上樣。