現(xiàn)代細胞生物學研究方法學生-免費閱讀
【正文】 反之，在一些觸發(fā)劑的作用下，許多轉錄因子與其他蛋白形成復合物后處于激活狀態(tài)而被轉運到核內。另外， importin?/RanGTP復合物也存在于核中，重新 importin? cycle。 能夠與 NES結合的 NES受體為 CRM1，被稱為 exportin, 在功能上與 Improtinα相對應的核轉運蛋白 。 ? 甲基化 CpG結合蛋白 2(MeCP2)可募集去乙酰化酶到甲基化的 DNA區(qū)域，使組蛋白去乙?；瘜е氯旧|濃縮。 3，能夠有效地整合來自不同轉導途徑的信號。 2）轉錄因子與特異 DNA序列的結合。一般 E3酶都不直接與 SUMO結合，它只結合 UBC9和底物蛋白，從而促進 SUMO與底物蛋白結合，完成 SUMO化。在所有的 SUMO家族成員中，甘氨酸－甘氨酸殘基對 SUMO結合是必須的。 ? 泛素鏈組裝因子 (Ubiquitin ChianAssembly Factor, E4)：結合泛素并催化E E 和 E3的組裝 ,對多聚泛素鏈的延長起重要作用 。 （特異性低） （特異性高） 泛 素 泛素是一種小蛋白，只有 76個氨基酸（ ）。 3，圖像為二維平面像 。 2） 利用 AFM,可使得細胞及生物大分子在生理溶液的條件下成像 。 蛋白質一級結構測定方法 生物質譜檢測制備技術 2D膠電泳－切膠－脫色 －脫水－還原－烷基化 －洗膠－脫水－泡漲－ 脫水－重泡漲－酶切－ 萃?。稍铮|譜分析 主要國際互聯(lián)網上的免費蛋白 數(shù)據庫檢索程序 ， 網址如下 : Mascot MSFit: Peptident: PeptideSearch: Services/PeptideSearch 數(shù)據庫檢索網址 7 9 9 . 0 1 3 3 9 . 4 1 8 7 9 . 8 2 4 2 0 . 2 2 9 6 0 . 6 3 5 0 1 . 0M a s s ( m / z )06 . 1 E + 401020304050607080901 0 0% IntensityS p e c 1 [ B P = 1 4 1 2 . 0 , 6 0 5 9 3 ]1 4 1 2 . 0 3 9 41 6 2 0 . 0 0 4 11 5 6 8 . 1 3 5 61 4 1 5 . 0 1 2 51 2 0 1 . 8 1 3 62 2 6 3 . 4 3 3 21 5 5 1 . 1 2 2 01 3 8 8 . 9 3 2 11 7 6 1 . 2 0 0 41 2 5 1 . 8 7 7 01 6 2 3 . 0 2 0 31 2 3 0 . 7 2 9 52 9 5 5 . 0 1 8 69 1 8 . 6 1 3 6 2 2 1 2 . 5 1 6 01 3 9 6 . 9 9 8 3 1 5 7 1 . 1 4 3 41 8 3 9 . 1 9 5 31 1 7 9 . 7 5 0 59 3 1 . 3 8 3 7 2 1 8 6 . 4 7 4 2 2 4 0 2 . 4 9 5 02 0 1 6 . 3 0 7 4 2 7 1 0 . 9 7 4 81 3 4 9 . 1 1 2 1 2 8 7 3 . 7 9 0 03 2 8 8 . 8 5 7 91 5 9 7 . 4 0 3 9 3 0 6 1 . 9 6 5 3 蛋白質空間結構測定方法 ? X射線衍射方法 測定蛋白質分子的晶體結構。 關鍵點：抗體，相應的熒光素標記的二抗；流式細胞儀。 ? 與 FRAP一樣， FLIP被用來測量膜或活細胞內分子運動的力度。 標記熒光素的樣品在熒光顯微鏡下經過不同波長的激發(fā)光激發(fā) ， 可以發(fā)射出不同顏色的熒光 。 ? 具有高天然性、高效率、高靈敏度、樣品量少、應用廣泛等優(yōu)點，但儀器昂貴、不易操作、價格高。通過熒光吸收裝臵檢測發(fā)出熒光的多少來反映模板量的高低，從而達到實時定量的目的。 ? RTPCR的用途很廣泛，既可以用來構建 cDNA文庫，也可以獲得感興趣的基因的 cDNA序列。 這種方法可以分析溶液中 、 細胞內的相互作用蛋白 ， 但只能是定性或半定量的實驗 。 ? ChIP與其他方法的結合，擴大了其應用范圍： CHIP與基因芯片相結合建立的 ChIPonchip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量 篩選； ChIP與體內足跡法相結合，用于尋找 反式因子的體內結合位點； RNAChIP用于研 究 RNA在基因表達調控中的作用。 ? FRAP用于測量 2維或 3維分子運動的力度。 ? 最大優(yōu)點：樣品無需染色，可以觀 察活細胞 流式細胞技術的應用 細胞分選 周期、凋亡測定 細胞表面蛋白定量 DNA滲入量測定 線粒體膜電位測定 流式細胞術定量分析 細胞凋亡率和細胞周期 DAPI染色細胞 流式細胞儀分析 可用于分選細胞 流式細胞術直接定量分析 細胞存活率 ? PI（碘化丙啶）染色細胞，不能透過活細胞膜，但可以結合到死細胞的 DNA碎片上。 熒光探針 JC1檢測線粒體膜電位 蛋白結構的分析 ? 利用 Edman降解法直接測定蛋白質分子中的肽段序列，并拼接出蛋白質分子的全序列。 熒光滴定方法分析小分子化合物 與蛋白的結合 關鍵點： 熒光分光光度計 純化蛋白（能夠自發(fā)熒光，脯氨酸、色氨酸基團） 蛋白質相互作用儀 Cell, virus, bacteria, protein, DNA and small molecular。 3，自動化程度高 。蛋白質通過動態(tài)相互作 用，形成大的復合體，在特定的時間和空間中完成特定的功能，這其中也發(fā) 生特定的蛋白質修飾。 甘氨酸殘基 C末端殘基 Positive charged 酶 系 統(tǒng) ? 泛素 激活酶 （ UbiquitinActivating Enzyme, E1） ：在人類僅發(fā)現(xiàn)一種 ，主要功能是激活泛素 。 SUMO化（ sumoylation）的功能與泛素化 (ubiquitination)不同，它并不使蛋白降解，反而加強它們的穩(wěn)定性或調節(jié)它們在細胞內的定位和分布 . SUMO家族成員包括 SUMO1， SUMO2， SUMO3。 甘氨酸殘基 Positive charged Negative charged Nterminal Positive charged 甘氨酸殘基 C末端殘基 C末端殘基 當 SUMO被 E1活化酶活化時，其碳端的苷氨酸殘基發(fā)生 ATP供能的腺甘
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