酶的分離純化ppt課件-免費閱讀
【正文】 在水過濾時利用反滲透膜的選擇性透過原理，通過設(shè)備的高壓泵對經(jīng)過反滲透膜的原水施加一定壓力，在壓力作用下原水中的水分子可以透過膜而滲析出來，而其他無機鹽、微生物與有機物等卻由于反滲透膜對這些物質(zhì)的截留特性而不能透過膜，從而可以獲得純凈的無離子水。（ ） ；可同時截留菌絲體和可溶性蛋白。 (3)減壓過濾 真空過濾、抽濾。 穩(wěn)定性好的酶，可取室溫； 超高速離心需冷凍。 對常數(shù)離心、高速離心、差速離心 ,指顆粒完全沉降到離心管底的時間 ,沉降時間或澄清時間 。常用的有蔗糖、甘油； 密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度； 操作：離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。） 聚丙烯酸（ 30~40%）等高分子聚合物 五、選擇性變性沉淀 ? 使雜蛋白變性沉淀，而酶不受影響； ? 熱穩(wěn)定性好的，可進(jìn)行熱處理； ? 改變 pH或加入某些金屬離子使雜蛋白除去； back 第四節(jié) 離心分離 離心：借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、密度的物質(zhì)分離的技術(shù)； 要根據(jù)欲分離物質(zhì)及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。 二、等電點沉淀法 圖例 介電常數(shù) 溶質(zhì)分子之間的引力 溶解度 有機溶劑 溶質(zhì)分子周圍的水膜破壞 酶和蛋白質(zhì)的氫鍵破壞 空間結(jié)構(gòu)變化 形成疏水層 三、有機溶劑的沉淀法 利用酶等物質(zhì)在有機溶液中的溶解度不同而使之分離的方法。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%飽和度 飽和 析出 析出 分段鹽析 ? 常用的鹽析劑是硫酸銨，因為它的鹽析能力強，在水中的溶解度大，價格便宜，濃度高時也不會引起蛋白質(zhì)活性喪失。 在低鹽濃度下 ,蛋白質(zhì)和酶溶解度隨鹽濃度升高而增加 鹽溶 鹽析 鹽濃度升高到一定濃度后 ,蛋白酶的溶解度又隨著鹽濃度升高而減少 ,蛋白酶沉淀析出 . 一旦蛋白質(zhì)溶液加入硫酸銨，后者吸引了大量水分子，使水籠無法有效隔離蛋白質(zhì)的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)之間的吸引，因而沉淀下來。 ? 另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。 pH值 為了防止酶的變性， pH不宜過高或過低；溶液的pH值應(yīng)遠(yuǎn)離酶的等電點，以增加酶的溶解度。 與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶需用有機溶劑提取。 鹽溶現(xiàn)象 : 在一定濃度的鹽存在下 ,酶的溶解度增加 . 鹽析現(xiàn)象 : 當(dāng)鹽的濃度太高 ,蛋白的濃度反而下降 ,從溶液中析出 .一般采用稀鹽溶液， ~。于溫室 30℃ 左右較早溶化。于生理食鹽水或 ，雖失去細(xì)胞膜，但原形質(zhì)沒有脫出。 常用的非離子型表面活性劑為： Triton(辛基酚聚氧乙烯醚 ,聚乙二醇辛基苯基醚 )。破壞程度與輸出功率、破碎時間密切相關(guān)，與頻率關(guān)系不大 。 突然降壓法 加壓至 30MP以上，打開出口閥突然降為常壓 爆破性減壓法 用氮氣或二氧化碳充壓至幾十至幾百大氣壓。 Back 一、機械破碎法 包括 : 溫度差破碎法 。 ?酶的分離純化工作 ,是酶學(xué)研究的基礎(chǔ) . ?酶的純化過程就目前而言 ,還是門實驗科學(xué) . 酶的純化過程與一般蛋白純化過程相比有本身獨有的特點 :一是特定的一種酶在細(xì)胞中含量很少 。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。應(yīng)用超聲波處理時應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在 。用少量乙醚洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。能溶解菌的酶分布很廣。 將待破碎的鮮材料在一定 pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。 ?目的 : 讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞 ?大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。 如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。 有機溶劑提取 二、影響酶提取的主要因素 溫度 為了防止酶變性失活，溫度不宜高； 多數(shù)酶的提取溫度在 5℃ 以下； 耐溫較高的酶可適當(dāng)提高溫度，以提高酶溶解度和擴散速率。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的 柱層析及電泳 方法。 鹽為什么會改變蛋白酶的溶解度
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