【正文】 分類學(xué)鑒定 論文題目（外文）： Diversity of Endophytic Bacteria from the Populus euphratica in kiyik ancient river and taxonomic identification of a novel bacterium 研 究 生 姓 名： 布阿依夏姆 三顆胡楊莖稈液混合之后采用常規(guī)培養(yǎng)法分離得到80 株純培養(yǎng)物。 其中屬于 γ 變形菌的細(xì)菌為 49 株，占分離菌株的 %（ 49/80）；屬于厚壁菌門的細(xì)菌為 15 株，占分離菌株的 %（ 15/80）；屬于 α 變形菌綱的細(xì)菌為 10 株，占分離菌株的 %（ 10/80）；屬于放線菌門的細(xì)菌為 7 株，占分離菌株的 %（ 7/80）；屬于擬桿菌門的細(xì)菌為 1 株，占分離菌株的 %（ 1/80）。 對(duì)潛在新種的詳細(xì)多相分類學(xué)研究結(jié)果表明， 菌株 KBL49 是短桿狀，無(wú)鞭毛，嚴(yán)格 好氧 ， 細(xì)胞內(nèi)積累 類脂粒（ PHB，即 polyβ hydroxybutyric acid 聚 β 羥基丁酸）的革蘭氏陰性菌株。 主要脂肪酸組分有 C16:0、 Summed Feature C17:0 cyclo、 C19:0 cyclo w8c、 C12:0、 Summed Feature C12:0 3OH 和 C10:0 3OH。 10 isolates belong to αproteobacteria, occupy % (10/80) of total isolates。 endophytic bacteria。樹(shù)高一般 1530 米，異形葉，雌雄異株，是干旱荒漠區(qū)生長(zhǎng)的植物，從生物學(xué)特征上表現(xiàn)為表皮角質(zhì)層較厚，葉面積相對(duì)較小，以此減少蒸騰作用帶走的水分；根系發(fā)達(dá)，以獲得足夠的水分供應(yīng)其本身的生長(zhǎng)和蒸騰耗水 [1]。 胡楊林分布狀況 胡楊廣泛分布于阿爾及利亞，中國(guó)，埃及，印度，伊朗，伊拉克，以色列，利比亞，巴基斯坦，阿拉 伯?dāng)⒗麃喒埠蛧?guó)，土耳其，土庫(kù)曼斯坦等的近 20 個(gè)歐、亞、非洲國(guó)家。 Kiyik 河胡楊林 在塔河中游（沙雅縣至尉犁縣）主河道的南面，塔克拉瑪干沙漠的北部邊緣荒漠區(qū)，遺留著歷史上由于塔河改道而干枯的 6 條較大的廢棄古河道遺跡。 2 植物內(nèi)生菌概況 植物內(nèi)生菌概念 植物內(nèi)生菌 一詞由希 臘語(yǔ)中的《 endo》（在 ? 之內(nèi)）和《 phyton》（植物）組成。其后，在 1997年 Hallmann等人指出 [8]，植物內(nèi)生菌是指從表面消毒的植物組織中分離而得到或從植物內(nèi)部獲得的，但它們的存在并未使植物的表型特征和功能有任何改變的細(xì)菌和真菌。 一些內(nèi)生菌只將一種植物作為宿主，而另一些則有多種宿主植物。 植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物種類及其功能多樣性 植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物種 類繁多，結(jié)構(gòu)多樣并具有各種生物學(xué)活性，主要有萜類、生物堿、皂苷類、芳香類、多肽類等 [13]。研究表明，感染內(nèi)生菌的植物宿主往往具有生長(zhǎng)快速、抗逆境、抗 病害、抗動(dòng)物危害等優(yōu)勢(shì)，比未感染植株更具生存競(jìng)爭(zhēng)力 。國(guó)際上已有許多從不同植物中分離可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的報(bào)道。 Anastasia Venieraki , Maria Dimou等人從希臘不同地區(qū)的小麥根際中分離了 17株可培養(yǎng)固氮菌，隸屬于 3個(gè)屬，并且研究促進(jìn)植物生長(zhǎng)的菌株的特性 [20]。截至到 20xx年在各種植物中發(fā)現(xiàn)的可培養(yǎng)植物內(nèi)生細(xì)菌已超過(guò) 129種，分別屬于 54個(gè)屬 [23] ,其中分離到的新種也相當(dāng)可觀。因此，這種方法僅能培養(yǎng)出極少數(shù) ( 少于 1% ) 的微生物。每個(gè)平板上有 96 個(gè)微井，其中 95 個(gè)微井的干膜上都含有碳新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 13 源基質(zhì)和氧化還原染料，一個(gè)不含碳源的微井用作對(duì)照。方法的主要步驟是通過(guò)提取土壤微生物中的某種生化成分并純化，然后利用氣、液相色譜等化學(xué)手段對(duì)該種化學(xué)成分進(jìn)行分類鑒定。土壤宏基因組學(xué)的主要任務(wù)之一就是揭示土壤微生物群落多樣性。包括限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài) (restriction fragment length polymorphism， RFLP)、核糖體間隔區(qū)分析 ( ribosomal intergenic spacer analysis，RISA)、 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA( random amplified polymorphic DNA， RAPD)變性新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 14 劑濃度梯度凝膠電泳 (denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE)、溫度梯度凝膠電泳 (temperature gradient gel electrophoresis， TGGE)、 時(shí)間溫度梯度凝膠電泳(temporal temperature gradient gel electrophoresis， TTGE)和 DNA 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism， SSCP)等技術(shù)。 生理生化特征 對(duì)原核生物生理生化特征的比較也可以說(shuō)是間接進(jìn)行基因組之間的比較。 蛋白質(zhì)分析 [29] 研究蛋白質(zhì)組成差異最常用的方法是全細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)電泳分析。 在細(xì)菌多相分類研究中 通常采用可溶性蛋白或全表蛋白提取液進(jìn)行電泳圖譜比較，或比較通過(guò)酶切電泳遷移率。 DNADNA 同源性分析 核酸雜交技術(shù)，在 1960 年由 Marmur, Doty 等人 [30][31]首次提出， Carl L. Schildkraut 等人 [32]應(yīng)用于 DNADNA 同源性研究之后的大約 50 年里，被作為原核 生物物種鑒定界限的金標(biāo)準(zhǔn) [33]。細(xì)菌化學(xué)特征分析包括脂肪酸、分枝酸、呼吸醌和細(xì)胞壁肽聚糖組分的分析。 為了進(jìn)一步補(bǔ)充和完善干旱極端環(huán)境下微生物類群分布特性，全面系統(tǒng)的弄清胡楊林片區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌的類型，種群結(jié)構(gòu)，分布狀況，構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，挖掘出一批當(dāng)?shù)匦戮N和罕見(jiàn)菌種，進(jìn)行目前 kiyik 河上游細(xì)菌分離鑒定以及多樣性分析的研究。 技術(shù)路線 采集樣品細(xì)菌的分離與純化形態(tài)學(xué)觀察16S rDNA 測(cè)序 系統(tǒng)發(fā)育分析多相分類學(xué)鑒定相似率 菌種庫(kù)的構(gòu)建相似率 DNA G+Cmol % 含量的測(cè)定細(xì)胞脂肪酸分析DNA 分子雜交醌類、極性脂檢測(cè)多相分類學(xué)鑒定菌種庫(kù)的構(gòu)建新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 17 第 二章 Kiyik 河胡楊內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及多樣性分析 實(shí)驗(yàn)材料與方法 樣品來(lái)源 本課題組在 20xx 年 4 月從 分布在塔河中游（沙雅縣至尉犁縣）主河道南面的 Kiyik 古河道胡楊林中采集了胡楊莖桿液樣品。 43′ 22″ E 85176。樣品地理位置及采集過(guò)程見(jiàn)圖 1。 細(xì)菌的分離與 CFU 值的計(jì)算 混合液樣 中取出 10ml， 添加至 90ml 滅菌過(guò)的生理鹽水中， 37℃下以 120rpm震蕩 25min， 以 稀釋涂布平板法 [35]分別涂布在 LB、 NA、 MA 和 KB 等四種培養(yǎng)基上 ，在 37℃下培養(yǎng) 2 到 7d。 2) 將涂片自然干燥。 6) 用吸水紙吸取多余水分，自然干燥。 3) 碘液作用 1min，水洗，吸干。深紫色為革蘭氏陽(yáng)性，紅色為革蘭氏陰性細(xì)菌。 4) 將沉淀溶于 800μl裂解液，吹打混勻。 7) 上清加兩倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇， 14000rpm離心 7min. 8) 沉淀溶于 500μl 70%乙醇， 1000rpm 離心 2min，棄上清，干燥。 3) 得到的 DNA 可直接用于 PCR 擴(kuò)增，也可以按照方法一的步驟 69 進(jìn)行進(jìn)一步純化。在ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫(kù)（ 親緣關(guān)系菌株的 16SrRNA 基因序列和 genebank 注冊(cè)號(hào)，通過(guò) ClustralX 程序進(jìn)行多序列匹配排列 [40]，并用 軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化矩陣跟軍 Kimura 雙參數(shù)模型估算 [41]，采用鄰近法（ neighborjoining method） [42]構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，以 1000 自展重復(fù)次數(shù) [43]對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 甘油保藏 在 500μl菌懸液加等體積 50%的甘油， 20℃放一天之后轉(zhuǎn)移至 80℃保藏。 4) 滅一些移液管，竹簽，脫脂棉。 8) 用移液管將斜面中的牛奶菌液混合均勻后像凍干管中 加入。 12) 將準(zhǔn)備好的凍存管在 4℃保存。見(jiàn)圖組 2 和表 3。 圖 3 菌株在 不同培養(yǎng)基上 的 生長(zhǎng)情況 基于 16S rRNA 基因序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)發(fā)育分析 從 kiyik 河 GPS 位點(diǎn)為（ N40176。 19′ 18″），（ N40176。 其中 的Pseudomonas xinjiangensis 為 優(yōu)勢(shì)種 ， 共 有 22 株（表 4）。 屬于假單胞菌的 22 個(gè)菌株（ KBK41 KBK63 KBL45d、 KBL4KBL4 KBL41 KBL415d、 KBL42 KBL42 KBL4 KBL4KBL550、 KBL64 KBM21 KBM32 KBM63 KBN13d、 KBN22KBN KBN16H、 KBN42 KBK31 KBL542B、 ）與 Pseudomonas xinjiangensis 有著 %的序列相似性， 10 個(gè)菌株（ KBL43 KBM2KBM21 KBM32 KBK62 KBM21 KBN41 KBM2 KBM63KBL410）與 Pseudomonas sabulinigri 有著 %的序列相似性， 2 個(gè) 菌株 （ KBL43 KBN417） 與 Pseudomonas azotifigens 分別有 %， %的序列相似性 ， 1 個(gè)菌株（ KBN311）與 Pseudomonas pelagia 有 %的序列相似性 ；屬于根瘤菌的 9 個(gè)菌株（ KBN4 KBK31 KBK31 KBK4KBK638 、 KBL45x 、 KBL538 、 KBK538 、 KBN18 ）與 Rhizobium rosettiformans 有著 %的序列相似性；屬于微桿菌屬 (Microbacterium)的菌株 KBN13 與 Microbacterium hydrocarbonoxydans 有 %相似性；屬于嗜鹽菌屬的菌株 KBM29 與 Halomonas meridiana 有 %相似性，菌株KBM431 與 Halomonas desiderata 有 %相似性；屬于 Nesterenkonia 屬的菌新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 28 株 KBL47 與 Nesterenkonia aethiopica 有 %相似性；屬于 Nocardioides 屬的菌株 KBL415x 與 Nocardioides alkalitolerans 有 %相似性。 表 4 Kiyik 河胡楊可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu) 及 16SrDNA 序列同源性 Strainr Phylum Genera Similarity bacteria Similarity KBN13 Actinobacteria Microbacterium Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM 16089(T) KBN14 Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM 16089(T) KBL41 Microbacterium sedminis YLB01(T) KBL47 Nesterenkonia Nesterenkonia aethiopica DSM 17733(T) KBL42 Nesterenkonia suensis SuaBAC020(T) KBN119 Nesterenkonia suensis SuaBAC020(T) KBL415X Nocardioides Nocardioides alkalitolerans KSL1(T) KBM23p Alphaproteobacteria Rosomonas Resomonas aestuarii JC17(T) KBN420 Rhizobium Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK311 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK313 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK43 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK638 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBL45x Rhizobium rosettiformans W3(T) KBL538 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBK538 Rhizobium rosettiformans W3(T) KBN18 R