【正文】 其中 的Pseudomonas xinjiangensis 為 優(yōu)勢(shì)種 ， 共 有 22 株（表 4）。 12) 將準(zhǔn)備好的凍存管在 4℃保存。在ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫（ 親緣關(guān)系菌株的 16SrRNA 基因序列和 genebank 注冊(cè)號(hào)，通過 ClustralX 程序進(jìn)行多序列匹配排列 [40]，并用 軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)化矩陣跟軍 Kimura 雙參數(shù)模型估算 [41]，采用鄰近法（ neighborjoining method） [42]構(gòu)建的進(jìn)化樹，以 1000 自展重復(fù)次數(shù) [43]對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。深紫色為革蘭氏陽性，紅色為革蘭氏陰性細(xì)菌。 細(xì)菌的分離與 CFU 值的計(jì)算 混合液樣 中取出 10ml， 添加至 90ml 滅菌過的生理鹽水中， 37℃下以 120rpm震蕩 25min， 以 稀釋涂布平板法 [35]分別涂布在 LB、 NA、 MA 和 KB 等四種培養(yǎng)基上 ，在 37℃下培養(yǎng) 2 到 7d。 為了進(jìn)一步補(bǔ)充和完善干旱極端環(huán)境下微生物類群分布特性，全面系統(tǒng)的弄清胡楊林片區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌的類型，種群結(jié)構(gòu)，分布狀況，構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹，挖掘出一批當(dāng)?shù)匦戮N和罕見菌種，進(jìn)行目前 kiyik 河上游細(xì)菌分離鑒定以及多樣性分析的研究。 蛋白質(zhì)分析 [29] 研究蛋白質(zhì)組成差異最常用的方法是全細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)電泳分析。方法的主要步驟是通過提取土壤微生物中的某種生化成分并純化，然后利用氣、液相色譜等化學(xué)手段對(duì)該種化學(xué)成分進(jìn)行分類鑒定。 Anastasia Venieraki , Maria Dimou等人從希臘不同地區(qū)的小麥根際中分離了 17株可培養(yǎng)固氮菌，隸屬于 3個(gè)屬，并且研究促進(jìn)植物生長(zhǎng)的菌株的特性 [20]。 一些內(nèi)生菌只將一種植物作為宿主，而另一些則有多種宿主植物。 胡楊林分布狀況 胡楊廣泛分布于阿爾及利亞，中國，埃及，印度，伊朗，伊拉克，以色列，利比亞，巴基斯坦，阿拉 伯?dāng)⒗麃喒埠蛧?，土耳其，土庫曼斯坦等的?20 個(gè)歐、亞、非洲國家。 主要脂肪酸組分有 C16:0、 Summed Feature C17:0 cyclo、 C19:0 cyclo w8c、 C12:0、 Summed Feature C12:0 3OH 和 C10:0 3OH。 碩士研究生學(xué)位論文 新 疆 大 學(xué) 論文題目（中文） ： Kiyik 河胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析及一株潛在新種的多相分類學(xué)鑒定 論文題目（外文）： Diversity of Endophytic Bacteria from the Populus euphratica in kiyik ancient river and taxonomic identification of a novel bacterium 研 究 生 姓 名： 布阿依夏姆 基于表型特征，化學(xué)分類特征和遺傳學(xué)特征分析結(jié)果，提議將菌株 KBL49 歸類為假單胞菌屬的一個(gè)新物種，并命名為 Pseudomonas Tograkense 。中國仍是當(dāng)今世界上胡楊分布范圍最廣、數(shù)量最多的國家。 Petrini[11]表明，某些內(nèi)生菌在寄主科水平上有專一性。在國內(nèi)河北大學(xué)生科院的 Jigang Han等人把毛竹根際，根表面和根內(nèi)組織作為樣品使用 2種培養(yǎng)基分離了 182株菌株，鑒定了屬于 22個(gè)屬的 56個(gè)不同的分類單元的 16S rDNA序列 [21]。常用的微生物多樣性生物標(biāo)記法有 : 磷脂脂肪酸分析法 和呼吸醌指紋法。關(guān)系密的菌株在一定生長(zhǎng)期，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類有很高的相似性。 本研 究的目的是采集 kiyik 河古河道胡楊林胡楊莖桿液樣，經(jīng)過篩選得到純化菌株，用現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法對(duì)分離到的菌株進(jìn)行多相分類，以確定分離菌株的分類學(xué)地位，并采用 16S rRNA 基因序列基礎(chǔ)上進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究微生物的多樣性。選出生長(zhǎng)的菌落數(shù)在 20300 個(gè)范圍之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每種培養(yǎng)基的 CFU/ml值。 細(xì)菌基因組 DNA 的提取 裂解液法 [37]（方法一）： 1) 菌株在 10ml 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將 菌液 120xxrpm 離心5min，收集菌體。 培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)度的計(jì)算 [44] 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)計(jì)算公式為： D=N／ NT 。 結(jié)果 細(xì)菌的分離與純化 本研究從 Kiyik 河胡楊林胡楊莖桿液中通過采用 KB， LB， NB和 MA 等四種培養(yǎng)基，共分離得到了 63 株內(nèi)生細(xì)菌。 出現(xiàn)頻率 其次 的 是 Rhizobium 屬和 Bacillus 屬，同樣都 占所分離菌株的% (9/80) (表 4)。 出現(xiàn)頻率最高的屬為假單胞菌屬 (Pseudomonas)，獲得的 35 株假單胞菌分別屬于 Pseudomonas xinjiangensis、 Pseudomonas sabulinigri、 Pseudomonas azotifigens 0246810121416LB NB KB MA桿狀+桿狀—短桿狀+短桿狀—球狀+球狀—新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 27 和 Pseudomonas pelagia 等 4 個(gè)菌種， 占所有分離菌株的 % (35/80)。 11) 氧焰灼燒封口（全面轉(zhuǎn)動(dòng)凍干管，使其均勻受熱否則容易出現(xiàn)玻璃泡）。得到的測(cè)序結(jié)果用 seqman 軟件包進(jìn)行拼接，在 genebank 中注冊(cè)序列，獲得注冊(cè)號(hào)。 6) 鏡檢。 引物 表 1 擴(kuò)增 16S rRNA 基因序列所采用的引物及序列 新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 19 試驗(yàn)方法 樣品的預(yù)處理 將兩個(gè)采樣位點(diǎn)的胡楊莖桿液樣品以等比例混合，配成混合液樣。 5 研究目的與意義 新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 16 上述研究初步對(duì)胡楊林極端環(huán)境下微生物類群進(jìn)行了研究 。而生化特征一般分為糖（醇）類代謝、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝、碳氮源利用能力、磷酸酯酶和 DNA 酶、溶血酶和凝固酶等其他酶活性及抑菌能力等。這種方法避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的缺陷，能比較客觀地評(píng)價(jià)微生物多樣性。 Pious Thomas .Ganiga K. Swarna等人通過 16S rDNA序列鑒定分離于香蕉莖尖培養(yǎng)物的可培養(yǎng)和免培養(yǎng)內(nèi)新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 12 生細(xì)菌，這些細(xì)菌隸屬于 5個(gè)門和 20個(gè)不同的屬 [19]。 內(nèi)生菌可以提高宿主植物的一些機(jī)制，包括形成的根外菌絲營(yíng)養(yǎng)吸收，刺激根系生長(zhǎng)，促進(jìn)植物的新陳代謝，促進(jìn)氮，磷的吸收，固氮，可以改善土壤或根系分泌物 [10]。胡楊繁殖力高，生長(zhǎng)慢、抗逆性強(qiáng)，對(duì)于改善生態(tài)環(huán)境，遏制沙漠化，保護(hù)生物多樣性等諸多方面具有重要作用，是下游綠色走廊的一道生態(tài)屏障 [3]。 基因組 DNA 的 G+Cmol%含量是 %。 阿木提 學(xué) 科 專 業(yè)： 生 物 學(xué) 研 究 方 向： 微生物學(xué) 導(dǎo)師 姓名 職稱：艾爾肯 關(guān)鍵詞： Kiyik 古河道；胡楊；內(nèi)生細(xì)菌；多樣性； 16S rRNA； 多相分類學(xué) 新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 5 Abstract The aim of this study was to identify the culturable endophytic bacteria isolated from storage liquid of six Populus Euphratica stands at the ancient Kiyik River which dried up 343years before. Through conventional dilutionplating method, we isolated 80 pure cultivable strains. Among them, 25 strains were isolated on LB plates, 21 were isolated on NB plates, 16 were isolated on KB plates and 18 strains were isolated on MA plates. Gram staining and simple staining test results of the isolates shows that 17 strains were grampositive, 63 strains were gramnegative, and 3 strains were coccus, 32 strains were rodshaped and 45 strains were short rodshaped. The phenotypic properties, biophysical characterization, 16S rRNA gene sequence analysis and phylogeic analyses showed that 80 strains could be placed into five phylogeic groups (γProteobacteria, αproteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes), 16 genera, and 24 species. Amomg them, 49 isolates belong to γProteobacteria, occupy % (49/80) of total isolates。新疆分布著目前全世界上最大的天然胡楊林。也有研究中發(fā)現(xiàn)，寄主種的水平上有專一性的一些內(nèi)新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 11 生真菌。首都師范大學(xué)生科院的 Lei Sun, Fubin Qiu等人把河北省農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站的水稻作為樣品分離了可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，克隆 192株菌株的 16S rDNA基因，并 鑒定了 52個(gè)分類單元的基因序列 [22]。 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù) 1) 熒光原位雜交技術(shù) ( FISH) 利用探針可以直接和環(huán)境土壤樣品、純培養(yǎng)菌落進(jìn)行原位雜交，獲得自然和人工狀態(tài)下微生物種類、相對(duì)豐度和空間分布信息 。對(duì)同等條件下培養(yǎng)的細(xì)胞可溶性蛋白進(jìn)行 SDSPAGE 電泳分析，可以得到反映生物基因組成的蛋白質(zhì)圖譜信息，進(jìn)而分析獲得菌株蛋白質(zhì)圖譜的多樣性特征。 本研究的意義在于：（ 1）由于受到的人類影響少，期待從原始環(huán)境中發(fā)現(xiàn)中國新記錄種和潛在的國際新種；（ 2）對(duì)于所鑒定的細(xì)菌進(jìn)行篩選，選擇對(duì)于我們生產(chǎn)生活具有重要意義的產(chǎn)物進(jìn)行研究。 細(xì)菌的純化 選擇出在菌落顏色、形狀、邊緣、隆起狀況等特性上有差異的菌株，使用平板劃線法獲得純培養(yǎng)物。 2) 加 1000ml預(yù)冷丙酮， 8000rpm離心 2min。 N 為每種培養(yǎng)基分離的細(xì)菌種類數(shù)量， NT 為分離細(xì)菌的全部種類數(shù)量。這些細(xì)菌有白色，奶油色，黃色，紅色，粉色和透明等菌落顏色。 除了這三個(gè)優(yōu)勢(shì)屬之外 還分離到了出現(xiàn)頻率較低的其他 13 個(gè)屬。 19′ 09″）的三個(gè)采樣點(diǎn) 胡楊莖稈液樣品中用四種培養(yǎng)基（ LB， NB， KB， MA）分離并鑒定出了屬于 16 個(gè)屬，24 個(gè)種的 80 株細(xì)菌 。 10) 將凍干管先放入 4℃冰箱中 30 分鐘，迅速轉(zhuǎn)移到 20℃冰箱中一個(gè)小時(shí)，再放入 70℃， 34 小時(shí)，在迅速轉(zhuǎn)移到凍干機(jī)上凍干（看到牛奶裂縫透明說明已干）。 表 2 擴(kuò)增 16S rRNA 基因片段的 PCR 體系及程序 系統(tǒng)發(fā)育 分析 PCR 產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序 16S rRNA 基因序列。 5) 用番紅染液 23min，水洗，干燥。 試驗(yàn)儀器 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司的 SWCJIF 生物超凈工作臺(tái)、上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠的 PYXDHS5065 恒溫培養(yǎng)箱、德國基因公司的 Eppendorf Mastercycler PCR 儀、美國 OLYMPUS 公司的 CX21FS1 OLYMPUS 顯微鏡、北京六一儀器廠的 DYYIII3A 水平電泳槽、 sigma 公司小型超速低溫離心機(jī)、美國 Alphaimage公司的 Alphaimage2200TM 凝膠成像儀 。為植物內(nèi)生菌增加了 10 個(gè)屬 18 個(gè)種。 生理特征是指，細(xì)菌在 固定條件下生長(zhǎng)能力。 3) 生物標(biāo)記法 生物標(biāo)記法主要是利用微生物細(xì)胞內(nèi)某種生化成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來區(qū)別微生物種類。 Rodrigo Mendes, Aline A, PizziraniKleiner 等人從甘蔗的根際，根內(nèi)和莖部取樣而分離了154株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌并鑒定 16S rDNA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的分離菌株隸屬于 4個(gè)屬，其中伯克霍德菌屬（ Burkholderia）占優(yōu)勢(shì) [18]。 內(nèi)生菌與宿主植物的關(guān)系 地球上有約 30萬種植物，它們分布的環(huán)境各也各有差異，這些多種多樣的植物為微生物提供了多元化的、極為復(fù)雜多樣的棲息地。 胡楊對(duì)極端環(huán)境有很強(qiáng)的抗逆性，在干旱沙漠地區(qū)唯一能生存的喬木，有 “ 生而一千年不死，死而一千年不倒，倒而一千年不朽 ” 的強(qiáng)大生命力。 與新疆大學(xué)碩士畢業(yè)論文 4 Pseudomonas xinjiangensis S33T 有 %的 16S rRNA 基因 序列 相似性和