【正文】 00 181。優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)是在實(shí)驗(yàn)條件下，脈沖閥的噴氣量最大。它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)：以一個(gè)中空的圓柱型磁鐵為軸，在其周圍纏繞線圈，與脈沖電源相連，在磁鐵的中空部分放有提升閥和主彈簧，提升閥的尖頭穿過磁鐵的頭部，抵雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測 15 住脈沖閥出氣口，磁鐵的外部頂端放有緩沖彈簧。脈沖閥工作時(shí)束源室的真空度一般保持在 103 Pa以下，脈沖閥停止工作時(shí)的真空度一般保持在 105 Pa左右 。 束源室 束源室是超聲分子束產(chǎn)生的主要場所，內(nèi)部有不銹鋼的氣體導(dǎo)管，樣品管、脈沖閥、熱電偶，以及圓錐形的撇取器。本章將對(duì)超聲分子束和雙步激光的實(shí)驗(yàn)裝置的幾個(gè)主要部分進(jìn)行較為詳盡的描述。其中有些影響很難消除，如解析激光的能量波動(dòng)和激光束的準(zhǔn)直等都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的不確定性。該模型主要內(nèi)容包括：當(dāng)解析激光能量保持不變時(shí)，隨 著電離激光（第二束激光）光強(qiáng)的增加，母體離子的信號(hào)逐漸增強(qiáng)；當(dāng)光強(qiáng)繼續(xù)增加時(shí)，母體離子信號(hào)便開始減弱，作者的解釋是由于過高的能量導(dǎo)致樣品發(fā)生解離；而當(dāng)解析激光的能量逐步增加時(shí)，出現(xiàn)最佳母體離子信號(hào)時(shí)所需電離激光的能量呈下降的趨勢，作者認(rèn)為是解析激光能量的增加導(dǎo)致分子更易于被光電離。第二束激光可以是紫外光也可以是真空紫外光，真空紫外激光（光子的能量大約為 10 ev）可以通過單光子對(duì)絕大多數(shù)的分子進(jìn)行 “軟 ”電離 [44]，這樣可避免碎片的大量產(chǎn)生。研究表明，短脈沖激光可以在 10 ns 時(shí)間內(nèi)上升到 108 K 的高溫 [43]，如此快的升溫速度，可以避免分子因均勻受熱而發(fā)生裂解。其基本原理如圖 13 所示 ： 在雙步激光系統(tǒng)中，解析階段和電離階段在空間和時(shí)間上是相互獨(dú)立的，這樣就可以對(duì)每一階段進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化。此外， MALDI對(duì)于低聚糖[36]、人工合成高分子物 [3738]也可以進(jìn)行有效的分析。 MALDITOFMS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測試手段，并正扮演著越來越重要的作用。從此，不斷有新的、更雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測 6 高效的基質(zhì)被報(bào)道，例如以多孔硅作為基質(zhì)，使得 MALDIMS的靈敏度越來越高，應(yīng)用越來越廣泛。同時(shí)在生物藥學(xué)領(lǐng)域也是不可或缺的重要手段，如在糖蛋白、糖肽的糖基化位置以及寡糖組分的測定中都有很好的應(yīng)用 [2426]。影響初始液滴產(chǎn)生的主要因素有：溶液流速、溶液的電阻系數(shù)和溶液的表面張力。這些方法的發(fā)明使有機(jī)質(zhì)譜的應(yīng)用拓展到高極性、難 揮發(fā)和熱不穩(wěn)定樣品的范圍，奠定了對(duì)生物大分子進(jìn)行進(jìn)一步分析的基礎(chǔ)。此后伴隨著快電子技術(shù)、大面積檢測器技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和機(jī)械加工技術(shù)的不斷進(jìn)步， TOFMS的性能也不斷提高。反射式飛行時(shí)間質(zhì)譜儀與直管飛行時(shí)間質(zhì)譜儀相比，多了一個(gè)用于能量聚焦從而提高質(zhì)量分辨的離子反射器。在 19461972 年的 20 多年間一直沒有大的發(fā)展，分辨率 一直 徘徊在幾百的量級(jí)。在電場中加速的電荷數(shù)相同的粒子，獲得的 能量相同，于是其飛行速度不同。 4. 結(jié)構(gòu)簡單易于制造和使用。 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測 3 與其他類型的質(zhì)譜儀相比，飛行時(shí)間質(zhì)譜有以下特點(diǎn)： 1. 分析速度快 : 單次測量可以得到被 分析體系的質(zhì)譜全圖。此外，四極桿質(zhì)譜的流通率大概在百分之十左右，一次只能檢測分析某一質(zhì)量的離子，大大的降低了工作效率。 目前常用的質(zhì)譜儀是飛行時(shí)間質(zhì)譜和四極桿質(zhì)譜。它吸取了各種技術(shù)的特長，彌補(bǔ)了彼此間的不足，并及時(shí)利用各種學(xué)科及技術(shù)的最新成就，是極具生命力且比較成熟的一種儀器。由于此類儀器具有離子俘獲功能，所以也很容易實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜檢測。 在此領(lǐng)域中四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、離子回旋共振質(zhì)譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜是最常見的幾種生物質(zhì)譜儀。 雙步激光質(zhì)譜法應(yīng)用于質(zhì)譜分析在上世紀(jì) 80年代就有報(bào)道 [5],并且近年來在氨基酸和短肽，大氣環(huán)境污染物多環(huán)芳烴 (PAHs)，化學(xué)添加劑，外太空礦物質(zhì)以及人類代謝產(chǎn)物等的成分解析上也取得了很大的成就。隨著激光技術(shù)的發(fā)展，上世紀(jì) 70年代開始了激光技術(shù)與質(zhì)譜方法相結(jié)合 [2]，最初應(yīng)用于光電離光譜和分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域 [3,4]。 Tissue。經(jīng)初步推測，其最低檢測濃度可達(dá) 106 mol/L以下。結(jié)果表明：該質(zhì)譜峰避開了純組織背景信號(hào)較復(fù)雜的區(qū)域，提高了檢測信號(hào)的信噪比。 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測 II 3）應(yīng)用雙步激光質(zhì)譜方法對(duì)生物組織中的藥物分子進(jìn)行了探測研究。對(duì)于固體樣品的進(jìn)樣，還自主設(shè)計(jì)安裝了二維平移裝置。 通過對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的改進(jìn)，本論文詳細(xì)探討了應(yīng)用雙步激光質(zhì)譜法對(duì)生物組織切片中藥物分子的原位探測，并優(yōu)化相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件。雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測 I 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測 專業(yè)名稱： 光學(xué) 申請(qǐng)者姓名：王紅磊 導(dǎo)師姓名： 胡勇軍 摘 要 激光光電離作為一種獨(dú)特的電離技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于質(zhì)譜領(lǐng)域。在雙步激光系統(tǒng)中，解析階段和電離階段在空間和時(shí)間上是相互獨(dú)立的，這樣可以方便的對(duì)每一 階段進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化。在雙步激光質(zhì)譜系統(tǒng)中較為關(guān)鍵的接口上，采用了進(jìn)樣桿模式。整套裝置通過手動(dòng)閘板閥和 O型密封圈使真空系統(tǒng)與外界隔絕，可以在保持真空的狀態(tài)下更換樣品。而預(yù)先在活體中注射有藥物分子 MB腫瘤組織的質(zhì)譜圖中，藥物分子 MB的質(zhì)譜主峰為 285 Da，出現(xiàn)在質(zhì)譜圖中質(zhì)量數(shù)較高的區(qū)域。本檢測方法最大的特色是原位檢測生物組織中的藥物分子。 SPI。隨著離子光學(xué)理論的發(fā)展和完善，通過對(duì)離子運(yùn)動(dòng)軌跡的理論研究，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)碾妶龊痛艌鼋M合具有方向和速度聚焦的特性，于是質(zhì)譜儀的質(zhì)量分辨能力有了很大程度的提高 [1]。隨后，該方法便成為生物大分子的主要分析手段。特別是在大通量、分析速度要求快的生物大分子中，飛行時(shí)間質(zhì)譜（ TimeofFlight Mass Spectrometer, TOFMS） [6]成為唯一可以實(shí)現(xiàn)的分析手段。和電噴霧離子源結(jié)合使用時(shí)，利用電噴霧電離使分析物帶多電荷的特性可以檢測幾十萬甚至上百萬道爾頓的大分子。 在氣相色譜 質(zhì)譜 （ GC/MS） 和液相色譜 質(zhì)譜 （ LC/MS） 的連用中，離子阱是最常用的質(zhì)量分析器之一。但是，與傅立葉變換 離子回旋共振質(zhì)量分析器(FTICR)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器 (TOF)相 比 , 離子阱質(zhì)量分析器的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度不是很高 [7]。但四極桿質(zhì)譜所能覆蓋的質(zhì)量分析范圍不大，難以對(duì)于大質(zhì)量分子以及團(tuán)簇分子研究，也不能對(duì)所研究的離子進(jìn)行能量分析。離子的飛行時(shí)間 T 與其荷 質(zhì) 比有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此可以根據(jù)離子不同的飛行時(shí)間 T來區(qū)分和確定其荷 質(zhì) 比信息 。 3. 可測量范圍大，理論上被測物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)不受限制。對(duì)新生離子施加一個(gè)快速的脈沖的外電場，使正離子向負(fù)極方向飛行。 但是 直管飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的質(zhì)量分辨率僅達(dá)到幾百左右，在生物大分子和團(tuán)簇分子研究中仍顯得力不從心。其工作過程 : 光電離產(chǎn)生的離子，經(jīng)引出電場引至加速區(qū)，各種不同荷質(zhì)比的離子在加速區(qū)中經(jīng)同一電壓加速后獲得相同的動(dòng)能， 然后進(jìn)入漂移區(qū)作自由飛行至離子反射器，離子在離子反射器中獲得能量補(bǔ)償后再作自由飛行到達(dá)離子探測器表面而被檢測到。 另一項(xiàng)重要的革新則是 1987 年發(fā)明的垂直引入技術(shù)，不僅提高離子傳輸效率還為各種離子源與飛行時(shí)間分析器相連提供一個(gè)通用接口 [11]。 軟電離技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用 上世紀(jì) 八十 年代末，質(zhì)譜技術(shù)得以迅速發(fā)展，相繼發(fā)明了幾種 “軟電離 ”技術(shù)：即電噴霧電離（ Electrospray Ionization, ESI）、基質(zhì)輔助激光解析電離（ MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization, MALDI） 及本實(shí)驗(yàn)要采用的雙步激光解析 /激光電離 （ Twostep laser desorption/laser ionization mass spectrometry，L2MS） 。隨著小液滴中溶劑的不斷揮發(fā)，其體積逐漸減小，電荷密度增加，當(dāng)液滴中電荷之間的靜電斥力大于液滴表面張力的時(shí)候，液滴破裂成更小的小液滴，此過程不斷重復(fù)，樣品最終被霧化，形成氣相分子離子。由于其較高的靈敏度且可以分析混合物，目前該方法在生物大分子的檢測方面有著廣泛的應(yīng)用[1723]。 19世紀(jì) 80年代有幾個(gè)課題組一直在致力于解決利用激光解吸附離子化樣品分子難的問題； 1987年日本 Shimadzu 公司的工程師 Tanaka終于取得重大突破，他在大阪一個(gè)研討會(huì)上宣布利用基質(zhì)輔助激光解吸電離（ MALDI）方法成功的測定了生物大分子，隨后于 1987至 1988年間發(fā)表了兩篇論文對(duì)此成果進(jìn)行了報(bào)道，當(dāng)時(shí) Tanaka是 使用含有細(xì)金屬粉末的甘油作為基質(zhì)，雖然這種基質(zhì)后來并沒有得到更好的發(fā)展 [27]；緊接著德國的科學(xué)家 M. Karas和 利用有機(jī)基質(zhì)（煙堿酸）成功檢測了多種蛋白質(zhì)和寡核苷酸 [28,29]。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。在生物分子的研究中有關(guān)的結(jié)構(gòu)信息也是很重要， MALDI亦可以獲得部分結(jié)構(gòu)信息 [3435]。 雙步激光質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物組織中藥物分子的原位檢測 7 雙步激光解析 /激光電離（ L2MS） 雙步激光質(zhì)譜法與 MALDI 質(zhì)譜方法不同，雙步激光質(zhì)譜法采用兩束激光分別完成氣化 /解析和電離的任務(wù)。當(dāng)解析激光照射到承載有樣品的基體上時(shí)，被吸收的光在瞬間大部轉(zhuǎn)換成熱能，并傳遞給待測樣品，使其瞬間氣化 /解析 [42]。經(jīng)過一定時(shí)間的延遲，第二束激光（電離激光）被聚焦并引入到該氣團(tuán)，優(yōu)化兩者之間的延遲時(shí)間 , 這樣可以極大地提高電離的效率，有助于質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的增強(qiáng)，被電離的離子隨后被引入質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測。 針對(duì)該技術(shù)， Faccito 提出了一個(gè)階梯－轉(zhuǎn)換（ Ladderswitching）模型 [45]，該模型可以指導(dǎo)我們對(duì)所使用兩束激光的工作條件進(jìn)行優(yōu)化。作者指出：解析激光的能量和波長，電離激光的能量和光束的準(zhǔn) 直，兩束激光之間的延遲時(shí)間，基底的特性等均會(huì)使信號(hào)波動(dòng)進(jìn)而對(duì)定性和半定量的分析產(chǎn)生較大的影響。由于超聲分子束和雙步激光系統(tǒng)所探測的對(duì)象不同，二者在離子透鏡及同步時(shí)序控制上會(huì)有所不同。 雙步 激光 以及 超聲 分子束 實(shí)驗(yàn) 的質(zhì)譜 系統(tǒng)主要由 束源室和主腔體以及進(jìn)樣系統(tǒng)三部分組成， 而主腔體可分成電離區(qū)、飛行管、和離子檢測區(qū)三個(gè)區(qū)域。束源室的真空度由腔體頂端側(cè)邊的電離規(guī)管測量。脈沖閥是一 個(gè)可以在高壓腔體和高真空氣室之間以一定的頻率快速穩(wěn)定的進(jìn)行開關(guān)運(yùn)作的閥門。 實(shí)驗(yàn)中分子束的質(zhì)量尤為重要，這就需要在安裝脈沖閥的時(shí)候根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求對(duì)脈沖閥的工作條件進(jìn)行優(yōu)化。此時(shí)，脈沖閥優(yōu)化完畢。 本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜儀的整個(gè)主腔體約為 60 L,同樣用一整套真空抽取設(shè)施來維持主腔體的高真空 度。 離子透鏡是質(zhì)譜儀的核心組成部分。 P3為電極板接地。 圖 21 飛行時(shí)間質(zhì)譜 示意圖 Figure 21 The schematic of TOFMS 飛行管可以為離子提供足夠的飛行距離，使不同質(zhì)量的離子能夠在質(zhì)譜上分開。 MCP位于飛行管的末端，探測到的離子信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。這些電 子繼續(xù)撞 入第二塊MCP，經(jīng)過多次的撞擊后，此時(shí)的電子增益可以達(dá)到 106數(shù)量 級(jí)，如此在經(jīng) 過第三塊 MCP的增益放大，從第三塊 MCP中產(chǎn)生的 定向移動(dòng)的電子形成電流，有信號(hào)線將其導(dǎo)出并傳入信號(hào)采集和處理裝置示波器進(jìn)行采集收集 。在實(shí)驗(yàn)中，在電機(jī)的帶動(dòng)下緩緩的在質(zhì)譜儀中的電離區(qū)進(jìn)行位移，同時(shí)通過所配二維平移裝置可以幫助其在真空室中的定位。包括：兩臺(tái)泵浦激光器，倍頻晶體，以及光路轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。此時(shí)得到的激光能量最大， 模式最好。其原理是：稀有氣態(tài)介質(zhì)通過非線性效應(yīng)獲得入射輻射的高次諧波或和頻，其過程是每湮滅頻率為 ω波矢為 κ1的三個(gè)光子，便產(chǎn)生一個(gè)頻率為 3ω波矢為 κ3的光子，輸出頻率是輸入頻率的三倍。因此，只有在二級(jí)非線性極化率等于零時(shí)才滿足該條件。New和 Ward在 1967年首次報(bào)道了氣體介質(zhì)中三次諧波的產(chǎn)生。不同氣態(tài)介質(zhì)所產(chǎn)生的三倍頻區(qū)域不同，所以要根據(jù)所需波長選擇合適氣態(tài)介質(zhì)作為三倍頻氣體。由于 Xe在 110~120 nm的部分區(qū)域內(nèi)有負(fù)色散范圍，與 UV區(qū)域高強(qiáng)度輻射源的三倍頻相對(duì)應(yīng)，常被用作該區(qū)域的非線性介質(zhì)。從圖 25中可以看出，實(shí)驗(yàn)是以脈沖閥的開啟時(shí)間為時(shí)間零點(diǎn)，九百多微妙后觸發(fā) Xe燈， 165 181。在這套系統(tǒng)中，我們使用兩個(gè) DG535進(jìn)行時(shí)序控制。s 后觸發(fā)第二束電離激光的 Qswitch，同時(shí)觸發(fā)示波