熒光定量pcr-預覽頁
【正文】 注： Ct值是指樣品管的熒光信號達到某一固定閾值的 PCR反應循環(huán)數(shù)。利用己知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，只要獲得未知樣品的 Ct 值， 即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 （ 3）、理論上 PCR擴增效率為 100%，但實際上：DNA的每一次復制都不完全，實際應為： Y=X (1+E)n，其中 E代表擴增效率，通常 E≤1 通常 X在 1~105拷貝、循環(huán)次數(shù) n ≤30 時， E相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)的增加， E值逐漸減少， Y呈非固定的指數(shù)形式增加，最后進入平臺期。 單管實時熒光定量 RTPCR的標準曲線 目前熒光定量 PCR均采用外標定量 （ 1）、由于標準曲線的斜率 (Slope)為 1/lg(1+E)，可知 E=101/Slope1 ，如從標準曲線中知道 Slope=，則 E=101/1=，也有人將 (1+E)直接視為擴增效率 E，則 E=101/Slope，求得的 E值均在 1— 2之間，有時也有大于 2的結(jié)果。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。 六、 熒光定量 PCR的分類 實時熒光定量 PCR 包括探針類和染料類兩種 , 探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加。因此， SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈 DNA的數(shù)量有關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出 PCR體系存在的雙鏈 DNA數(shù)量。 SYBR Green I的優(yōu)點： SYBR Green I的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈 DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價格相對較低。 LC Green TM I染料法簡便、快速、精確性高 , 預期將會有很好的應用前景。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。常用的熒光基團是 FAM， TET， VIC， HEX。在復性溫度下，因為模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當加熱變性會互補配對的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。常用的熒光基團： FAM ， Texas Red 。當變性時，探針游離，兩基團距離遠，不能產(chǎn)生640波長的熒光。 （ 2）一旦線性擴增范圍確定以后，如何找到一個合適的方法檢測結(jié)果。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以傳統(tǒng)定量 PCR的缺點是：勞動強度大、定量不準確、重復性差。 （ 3）、線性關(guān)系好、線性范圍寬，由于熒光信號的產(chǎn)生和每次擴增產(chǎn)物成一一對應的關(guān)系，通過熒光信號的檢測可以直接對產(chǎn)物進行定量；定量范圍可在 0－ 1010拷貝 /毫升。 九、怎樣設計熒光定量 PCR實驗方案 基因序列的查找 引物、探針的設計 熒光定量 PCR方法的確定 引物探針合成標記 標準品的制備 反應液的配制 反應條件的設定 基數(shù)的設定、數(shù)據(jù)分析 引物設計通常遵守如下原則： A、引物與模板的序列要緊密互補。 E、引物的 3’ 端避免使用堿基 A；引物 3’ 端避免出現(xiàn) 3 個以上連續(xù)相同的堿基。 C、探針的 5’ 端應避免使用堿基 G。熒光定量 PCR技術(shù)可以對不同組織、不同處理之間（如藥物處理、物理處理和化學處理等）、不同發(fā)育階段基因表達差異進行檢測，檢測各基因在組織細胞中的表達豐度， 分析基因的表達調(diào)控、 mRNA 的表達模式等研究。 （ 5）、遺傳學及 SNPs 分析上的應用 熒光定量 PCR 技術(shù)還可以用在點突變分析、等位基因分析、 DNA 甲基化檢測、單核苷酸多態(tài)性（ SNP）分析及特異突變基因檢
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