第四節(jié)細(xì)菌和鏈霉菌的分子克隆載體-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 ii. 轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定 iii. 子代細(xì)胞質(zhì)粒分散不均勻 iv. 從酵母轉(zhuǎn)化體中可分離到與轉(zhuǎn)化前相同的質(zhì)粒 DNA v. 可整合到染色體中去，與 YIp整合過(guò)程相同。 4pBR322探針 假設(shè)宿主菌染色體的 ura3基因酶切得 3 kb片段 , 而 ARS片段酶切得 1 kb片段 . 3） YARp載體（酵母非著絲粒復(fù)制質(zhì)粒） kb酵母 DNA（ EcoRI片段）自我連接而成，該質(zhì)粒含有ARS1和 TRP1基因 該質(zhì)粒特點(diǎn) : i. 高拷貝 ,100200/cell。大多數(shù)釀酒酵母菌株中都含有 2μ質(zhì)粒， YEp復(fù)制所需的酶可由 2μ質(zhì)粒提供。 22μ質(zhì)粒探針 。 YC p R1C E N 3g a lKC EN 3 A T A A G T C A C A T G A T T G A T T T C C G A A T T T A G A G C A AC EN 1 1 C EN 6 A A A T A G C 2 5 2 b p 2 4 8 b p 2 0 0 b p I I I I I I I VYCp載體結(jié)構(gòu) 7. YLp載體 真核細(xì)胞染色體的末端有兩個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)：能使染色體保持穩(wěn)定，能成功地進(jìn)行 DNA復(fù)制。環(huán)狀質(zhì)粒經(jīng)限制酶切后的末端極不穩(wěn)定，極易發(fā)生重組，或發(fā)生降解，或發(fā)生重新環(huán)化。該類載體可分為兩類： 一類載體中存在一個(gè) DNA結(jié)合序列 (BD)，它與已知的釣餌序列融合；另一類載體則含有基因表達(dá)激活序列（ AD），它則與未知或已知的捕獵序列融合。 N o n i n t e r c t i n g p r o t e i n sAD B a i tP r o t e i nD N A B DL i b r a r yP r o t e i nO p e r a t o r s o r u p s t r e a ma c t i v a t i n g s e q u e n c e sP r o m o t e rR e p o r t e r g e n e ( s )I n t e r a c t i n g p r o t e i n s a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n o f r e p o r t e rAD B a i tP r o t e i nL i b r a r yP r o t e i nD N A B DO p e r a t o r s o r u p s t r e a ma c t i v a t i n g s e q u e n c e sP r o m o t e r R e p o r t e r g e n e ( s )t r a n s c r i p t i o nF i g u r e 1 . S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e b a s i c f o u n d a t i o n o f t h e M A T C H M A K E R s y s t e m s .p U C o r iADM C SE c o R IX h o IT R P 1p B 4 2 A D 6 . 4 5 k bA m prPG A L 1TADH12 μO(píng)ri雙雜交系統(tǒng)和載體 二、絲狀真菌克隆載體 1） 屬低等真核生物，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于培養(yǎng) 2） 基因結(jié)構(gòu)與高等真核生物的基因結(jié)構(gòu)具較大相似性，如內(nèi)含子數(shù)目、位置等 3） 用于生產(chǎn)某些具生物活性的基因產(chǎn)物更具吸引力，如糖基化、蛋白質(zhì)外泌 4） 有些絲狀真菌的的遺傳背景較為清楚 2. 絲狀真菌克隆載體 1） 自主復(fù)制載體 ，其復(fù)制起點(diǎn)來(lái)源于以下三類 DNA： i. 線粒體質(zhì)粒，如來(lái)自間型脈孢菌 ()線粒體質(zhì)粒 : pBR322+線粒體質(zhì)粒 +qa2+ pALS1 轉(zhuǎn)化粗糙脈孢菌 pALS2（高頻轉(zhuǎn)化小質(zhì)粒） ii. 類質(zhì)粒（ plasmidlike)，如由柄孢殼 (Fedospora auseniw)的類質(zhì)粒 (2539bp)所構(gòu)建的克隆載體可達(dá) 10009000/μg的轉(zhuǎn)化率，可重新分離，無(wú)重組發(fā)生，其復(fù)制起點(diǎn)序列與酵母和海拉細(xì)胞線粒體質(zhì)粒復(fù)制子序列相同。
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