【正文】 速均有。 特點： 用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 3）沉降的顆粒受到擠壓 。 ?適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì) 。 常用 氯化銫 （ CsCl）作為梯度介質(zhì)。 ?差速離心 是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。 蛋白質(zhì)的鹽析 硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響 離子強度 鹽 析 鹽溶 原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。 按下式計算，得表中數(shù)據(jù) B(S2S1) W= —————— 1AS2 A,B—— 常數(shù)，與溫度有關(guān)。 ? 高飽和度： 固體鹽添加法。 ? 3）沉淀再溶解后可用超濾 （ ultrafiltration） 、透析 （ dialysis） 或?qū)游?（ chromatography） 方法脫鹽。 當(dāng)溫度一定時 ， S0對于某一溶質(zhì)是常數(shù) ，用 β 表示 ， 鹽析方程式可改寫為： log S = β Ks I 兩種鹽析法： Ks分級鹽析法 ： 在一定的 pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì) Ks的不同，通過改變離子強度或鹽濃度（即改變 I值）的沉淀方法。 ?4) 溫度的影響： ?稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。 （二） 有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)） ? 利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。 （ 2） pH 值： 盡可能靠近其等電點。 3. 優(yōu)點： ?① 操作條件溫和 ， 不易引起生物大分子變性 。 ? ⑴ 熱變性 ? 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固， 加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。 ?特點： ?1）比化學(xué)沉淀法分離程度高 ?2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快 ?3）比蒸餾法能耗低 （一）溶劑萃取法 明確幾個概念： 料液： 供提取的溶液。 萃余液： 被萃取出溶質(zhì)后的料液 。 ? 萃取相濃度 C1 ?分配系數(shù) K0 = —————— = —— ? 萃余相濃度 C2 ? K0值隨溶液 pH的變化甚大，這是用萃取法實現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。 ?優(yōu)點： ?1） 每一水相中均有很高的含水量，為 ?酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境； ?2） PEG、 Dextran和無機鹽對酶等無毒 ?害作用，不會引起變性。 ? ? 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例 酶 菌 種 相系統(tǒng) ? 延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 鹽 ? 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽 ??半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽 ? 亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp. PEG/Dex ? 乙醇脫氫酶 Baker’s yeast PEG/ 鹽 ? 青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 鹽 雙水相萃取法的重要研究方向 —— 親和萃?。?親和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（ ligand）來提高分離選擇性。 ?臨界壓力： 在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。 ?2）降低壓力，使 SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。 構(gòu)造 表面活性劑極性基團在外，非極性基團在內(nèi)，形成非極性核心。 反膠團萃取原理 3. 表面活性劑及有機溶劑 ? 反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。 ?4. 優(yōu)點 ? 1）萃取率和反萃取率高。 ? 5）成本低。 材料：纖維素衍生物。 A:透析夾， B:透析， C:透析示意圖 （二）加壓膜分離 根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為 ： 截留顆粒 直徑 操作壓力 應(yīng)用 微濾 ~2?m 除菌 超濾 20A ~ ?m ~ 分離病毒及生物大分子 反滲透 20A ~13MPa 純水制備 微濾 (Microfiltration， MF) 一種靜態(tài)過濾，隨過濾時間延長，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞； 無流動操作滲透 液原料液超濾 (ultrafiltration， UF ) 一種動態(tài)過程，由泵提供推動力，在膜表面產(chǎn)生兩個分力：一個是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過膜面，另一個是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。 滲透與反滲透 Reverse Osmosis (RO) Nanofiltration (NF) Ultrafiltration (UF) Microfiltration (MF) Membrane Filtration 3. 電場膜分離 （ 1）電滲析： 在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。將植物色素溶液通過裝有 CaCO3 吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。 分配層析 ：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。 紙層析 ：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。離子交換纖維素需作酸堿處理。 平衡： 用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。 同時進(jìn)行分步收集和檢測。 ?吸附作用的強弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。 但為了便于解吸附，對于極性強的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進(jìn)行吸附。 吸附原理是 HA的 Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團作用。 4. 應(yīng)用 分離純化生物大分子 （二）凝膠過濾層析 凝膠過濾（ gel filtration）又稱分子篩層析（ molecular sieve chromatography）、排阻層析（ exclusion chromatography） ,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的 分子量不同 而進(jìn)行分離的技術(shù)。 Ⅲ . 其它組分 0Kd1,因分子大小而改變洗脫峰的位置 。 1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（ dextran gel) 商品名 :Sephadex 型號 Sephadex G－ 10至 G200 G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的 10倍。 型號 使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量） 含瓊脂糖（ ℅ ） 6B Sepharose 4B 2B 104～ 3 106 105～ 3 107 106～ 108 6 4 2 6B Sepharose CL 4B 2B 同上 同上 BioGel A 5m 15m 50m 150m 10～ 500 103 10～ 1500 10～ 5000 40～ 15000 100～ 50000 1000～ 150000 10 8 6 4 2 1 Sepharose及 Biogel A 型號 3）聚丙烯酰胺凝膠 （ polyacrylamide gel） 商品名為 BioGel,型號從 BioGel P－ 2至 P300， P值越大，孔徑也越大。 2）柱的選擇 采用 L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速 。 ? 5）膠的保存 ? 洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。 1）離子交換劑 ： 離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構(gòu)成。 2）洗脫 : 增加溶液的離子強度 梯度洗脫法 改變?nèi)芤旱?pH值 3）再生： 用 合溶液或 。 1. 原理 : 在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，然后通過降低流動相的離子強度，即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結(jié)合力大小，依次進(jìn)行解吸附。 4. 應(yīng)用 主要用于分離純化大分子物質(zhì)。 + C C C 配基 蛋白質(zhì) 固體載體 Affinity chromatography 2. 基質(zhì)的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 高度的親水性。 ⑤ 較好的理化穩(wěn)定性。 優(yōu)良配體須具備的條件： 1）與待純化的物質(zhì)有較強的親和力。 溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如：AHSepharose 4B 常用手臂 5. 操作： 1） 層析前： 制備親和層析劑 選擇 根據(jù)欲分離物質(zhì)特性 配基 選擇 根據(jù)配基分子大小及基團特性 載體 2）洗脫： 能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。 固定相（柱填料）： 常用 堅硬、耐高壓 ， 粒度小 的硅膠。 2. 分類 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)分類： 親和色譜： —— 親和力 吸附色譜： —— 吸附力 離子交換色譜： —— 離子交換能力 凝膠色譜 ： —— 分子大小而引起的體積排阻 分配色譜： —— 分配系數(shù) 分配色譜又可分為： 正相色譜： 固定相為極性，流動相為非極性。 流動相組成 ：常用 “ 甲醇 — H2O” 。 ? 電泳技術(shù) 是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進(jìn)行分離的實驗技術(shù) 。 3）溶液性質(zhì)： ? pH值：離 pI越遠(yuǎn)， v越快。 4）電滲： 在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。 支持介質(zhì)的作用 :防止電泳過程中的對流和擴散。 ③ 瓊脂糖凝膠電泳 ： 一般用于核酸的分離分析。 ?聚丙烯酰胺 和 瓊脂糖 是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)。 CH2=CH C=O NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH NH2 丙烯酰胺 N,N’甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1）化學(xué)催化系統(tǒng)： APTEMED 催化劑： 過硫酸銨 （ ammonium persulfate， AP） 加速劑： TEMED（ N， N， N’， N’四甲基乙二胺） 2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（ TEMED） 催化劑 : 核黃素（維生素 B2） 引發(fā)劑 : 光 TEMED的存在，可加速聚合。 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 Acr（ g） +Bis（ g） V（ ml） X100% Acr（ g） +Bis（ g） Bis（ g） X100% 樣品 分子量（ Da） 適宜的凝膠濃度（％） 蛋白質(zhì)