【正文】 陽離子交換劑 (可吸附 帶正電的蛋白質(zhì) ) 兩種離子交換劑 ? 陰離子交換劑： ? 常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基 2羥丙基 ? 陽離子交換劑： ? 常用羧甲基 CM — CH2COO－ ? 磺丙基 SP — C3H6SO3－ DEAE － C2H4N+(C2H5)2H QAE － C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 離子交換葡聚糖 ? 以 Sephadex G25, G50為骨架，接入離子交換基團。 ? 用 %NaN3防腐。 ? 3）加樣 ? 體積不能過多，不超過床體積的 5％，脫鹽時可在 10％左右。 以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。 Kd小的先流出 ， Kd大的后流出 。 1. 基本原理 大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。 3. 洗脫劑 要求： 粘度小，純度高， 穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分 ,易與目標(biāo)分子分離。 2）吸附劑的性質(zhì)： 活性炭： 常用的吸附介質(zhì)。 ?吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇 。 分離后： 再生，平衡，保存。 洗脫： 連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)改變緩沖液的 pH或離子強度。 ? 2）裝柱： 重力沉降法，要求 均勻，無氣泡。 薄層層析 ：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。 離子交換層析 ：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。 ? 色譜起源 色譜 組分 色素 石油醚 碳酸鈣顆粒 用色彩（ chroma）和圖譜（ graphs）組成色譜一詞（ Chromatography) 。（ 2）離子交換膜電滲析： 用離子交換膜代替一般的半透膜。 超濾原理的示意圖 ?利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。 1）透析膜的預(yù)處理： 目的： 除雜質(zhì)。 第二節(jié) 酶的精制 酶純化的基本原則： ①建立一個方便靈敏的分析方法； ②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟； ③常在低溫（ 4℃ ）條件下進行純化，以避免酶的變性。 ? 2）分離濃縮同時進行，溶劑可反復(fù)利用。 ?（ 1）表面活性劑 ? 常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活性劑，琥珀酸 2乙基己基酯磺酸鈉）。 表面活性劑非極性基團在外，極性基團在內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池（ water pool ）。 ?常用超臨界液態(tài) CO2作為萃取劑， ? 因為： ?1）液體 CO2無毒 ?2）臨界溫度（ ）接近常溫 ?3）臨界壓力（ ）較低 ?4）操作安全 ?超臨界 CO2萃取技術(shù)在生物、食品 ?等工業(yè)中的應(yīng)用 ? CO2萃取部分產(chǎn)品 ? 原料名稱 產(chǎn)物名稱 原料名稱 產(chǎn)物名稱 ? 小麥胚芽 胚芽油 豆子 豆油精煉油 ? 啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 凈油 ? 辣椒 辣椒紅色素 菊花根 除蟲菊酯 ? 當(dāng)歸 精油 紫草 紫草寧 ? 銀杏葉 銀杏內(nèi)酯 花生 精煉油 （四） 反膠團萃取 ? 1. 反膠團： 又稱反膠束（ Reversed Micelles） ? 指 表面活性劑 （ 由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù) 有機 溶劑 中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體 。 ? ?SCF性質(zhì) 介于液體和氣體之間 ： ?1) SCF密度接近于液體，溶解度高。 親和萃取酶實例 蛋白質(zhì) 配基 胰蛋白酶 胰蛋白酶抑制劑 磷酸果糖激酶 三嗪染料 甲酸脫氫酶 三嗪染料 葡糖 6磷酸脫氫酶 三嗪染料 ?（三） 超臨界流體萃取 ? 兼有蒸餾和溶液萃取的特征， 與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別 ：將超臨界流體作為萃取劑。 ： 兩種不同水溶性聚合物濃度達到一定值時，體系會自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。 ? 普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質(zhì)的分離， ? 因為 : ?1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑 ?2） 蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取 。 反萃?。?back extraction）： 完成萃取操作后， 將產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。 溶質(zhì)： 料液中欲提取的物質(zhì) 。 ? ⑵ pH變性 ? 等電點沉淀法是 pH變性法中的一種變體。 ?② 沉淀效能高 ， 使用少量的 PEG即可沉淀相當(dāng) ? 多的生物大分子 。 （ 3）離子強度： 采用 增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度 目的 防止蛋白質(zhì)變性 （ 4）蛋白質(zhì)濃度： 適當(dāng)，一般為 5? 20mg/ml （三） 等電點沉淀 (isoelectric precipitation) ? ? 蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低 ? 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點 ? 2. 使用方法 ? 單獨 使用 較少 （ 用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白 ） ， 多與其它方法聯(lián)合使用（ 如鹽析法 、 有機溶劑法 ） ， 因 蛋白質(zhì) 在等電點時仍有一定的溶解度 。 ? 1. 沉淀機理 ? 降低溶液的介電常數(shù) ? 部分地引起蛋白質(zhì)脫水 ? 2. 常用有機溶劑 ? 丙酮 ?乙醇 ?甲醇，用量一般為酶液體積的 2倍左右，終濃度為 70%。 ?濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。 β 分級鹽析法 ： 在一定離子強度下，通過改變?nèi)芤旱?pH及溫度的沉淀方法 。 3. 鹽析曲線的制作 ? 如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。不會大量增加溶液體積。 實際使用時，可直接查表 （各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。 不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀， 逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。 ?密度梯度離心 兼有以上兩種方法的特點，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。 特點： ?介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。 密度梯度離心示意圖 （ a）離心前 （ b）離心后 Density gradient ultracentrifugation 密度梯度離心 步驟： B. 加樣 3. 等密度梯度離心 又 稱 沉降平衡離心 （ sedimentation equilibrium centrifugation）。 差速離心分離示意圖 （ a）離心前的懸浮液 （ b）～（ e）離心不同時間后顆粒的沉降情況 2．密度梯度離心 （ density gradient centrifugation） 樣品在 密度梯度介質(zhì) 中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 優(yōu)點： 操作簡單 。 角式離心機和離心頭（轉(zhuǎn)子） ? 角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。 （二）離心機的種類 按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速） 高速 超速 名稱 轉(zhuǎn)速 (r/min) 注意事項 低速離心機 ?6000 常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡 高速離心機 6000? 25000 冷凍（防止溫度升高）， 離心管的精確平衡 超速離心機 25000 冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦）， 離心管的精確平衡 離心機的種類 實驗室離心機 ? 溫度類型： 常溫及冷凍 ? 超速離心機均為冷凍型。 兩者可換算或查測算圖。 （二）酸、堿溶液提取 （三）有機溶劑提取 四、 離心分離 （ 一） 基本原理 1. 離心力 Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （ 2? N/60） 2 N為離心機 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （ r/min ）； Fc通常以相對離心力 RCF（ relative centrifugal force）表示，即離心力 F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù) g）的多少倍。但為防止酶失活， ? 一般 采用低溫下（ 0~10℃ ） 操作。 三、酶的提取 (extraction) ? 把酶從生物組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。 ? 自溶法（ autolysis） : ? 細胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā) ?生溶解的現(xiàn)象。 ?3. 化學(xué)法 應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細胞膜作用，使細胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。 ? 2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。 ?高度純化 （ fine fractionation） （精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。 ?初步純化 （ rough fractionation） （提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。 二、細胞破碎 （一） 細胞壁組成 ?細胞壁的主要成分： ? 細菌：肽聚糖 (N乙酰萄糖胺， N乙酰胞壁酸 ) ? 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì) ? 真菌 : 多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖） ? 微生物 革蘭氏陽性細菌 革蘭氏陰性細菌 放線菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 15 ~ 50 10 ~ 13 同 G+ 100 ~ 300 100 ~ 250 層次 單層 多層 多層 多層 主要組成 肽聚糖 (40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白質(zhì) 脂多糖 (1%? 2%) 肽聚糖 (5% ~ 10%) 脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%) 磷脂 蛋白質(zhì) 葡聚糖 (30% ~ 40%) 甘露聚糖 (30%) 幾丁質(zhì) (1% ~ 2%) 蛋白質(zhì) (6% ~ 8%) 脂類 (% ~ %) 多聚糖 (80% ~ 90%) 脂類 蛋白質(zhì) 各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 細菌細胞壁的結(jié)構(gòu) 酵母菌細胞壁的結(jié)構(gòu) M— 甘露聚糖； P— 磷酸二酯鍵； G— 葡聚糖 （二）細胞破碎的方法 ? 機械法 ? 物理法 ? 化學(xué)法 ? 生物法（酶解） ?： ? 1）液體剪切：攪拌、勻漿。 ? 3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。 ?（ enzymatic lysis） ： ? 外加酶法： ? 根據(jù)細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點，選用適當(dāng)?shù)拿?。 ： 測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。 ? 注意：溫度升高，溶解度加大。 提取方法 ： （一）鹽溶液提取 常用稀鹽（常用 NaCl）溶液（鹽溶），對酶穩(wěn)定性好、溶解度大 ，最常用。 ?高速離心（超速），常以 相對離心力 （ RCF）表 示，如： 65000g。 常用 S表示某些生物大分子、亞細胞及亞細胞器的大小，如 16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在 1 ~ 200之間。 離心的形式 ? 角式及外擺式：外擺式一般為低速， ? 角式由低速到超