分子克隆工具酶 (2)-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 nuclease）：一些線粒體、葉綠體、核 DNA和 T偶數(shù)噬菌體的內(nèi)含子編碼內(nèi)切酶（稱為 Iprefix）或內(nèi)含肽（ intein）具有內(nèi)切酶活性（稱為 PIprefix）。 對(duì)側(cè)翼長(zhǎng)度敏感性高的酶有 AccⅠ 、 HindⅢ 、 PstⅠ 等，側(cè)翼 3個(gè)堿基以上也未必理想。 某些噬菌體 DNA中的某些相同的酶切位點(diǎn)對(duì)酶的敏感性不同。 原因：切割時(shí)需要同時(shí)與 2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用（如 NarⅠ 等），或識(shí)別和切割時(shí)要求在 DNA上有 2個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中1個(gè)是另 1個(gè)的被切割時(shí)起激活作用的變構(gòu)位點(diǎn)。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 17 體積和溫度 ：反應(yīng)體系一般用 20100 μL，視情況可大可小。 七 、 限制酶的星活性 (star activity) ? 在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下 ， 限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識(shí)別序列不同但相似的序列 ， 降低酶切反應(yīng)的特異性 ， 這種改變的特殊性稱為限制性核酸內(nèi)切酶的 星活性 。 ④ 高 pH， 大于 。 ? 辦法：對(duì)因改進(jìn)。 九 、 酶切位點(diǎn)的引入 現(xiàn)代基因工程中通過(guò)引物化學(xué)合成等方式可以很方便進(jìn)向目標(biāo)位置引入設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn) 。 ? 大腸桿菌中的 dcm甲基化酶在 5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶 C5位上引入甲基，受其影響的酶有 EcoRII等，但 BglI、KpnI不受影響。 酵母中重復(fù)序列以外富含 GC的識(shí)別序列較少。 ② 整個(gè)操作應(yīng)在 0℃ 進(jìn)行 ， 即在冰浴中進(jìn)行 ， 而且是在加入其它試劑之后 ， 最后加入酶 。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 24 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途 ① 在特異位點(diǎn)上切割 DNA， 產(chǎn)生特異的限制性酶片段 。 ⑤ 改建質(zhì)粒。 一些酶對(duì) Dam甲基化敏感 ，如 BclⅠ 、 ClaⅠ 、 XbaⅠ 等。 一些酶 對(duì) Dcm甲基化不敏感 ，如 BanⅠ 、 BglⅠ 、 KpnⅠ 等。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 27 三、甲基化對(duì)限制酶切的影響 修飾酶切位點(diǎn) ：敏感的酶不能切開(kāi)。 第三節(jié) DNA聚合酶 DNA聚合酶（ DNA polymerase）的主要活性是催化 DNA的合成（在具備模板、引物、 dNTPs等情況下）及其相輔的活性。 ? Klenow酶仍擁有 5’→3’ 的 DNA聚合酶活性和 3’→5’ 的核酸外切酶活性，但 失去了 5’→ 3’ 核酸外切酶活性 。 （ 2）基本用途 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 37 四、 T7噬菌體 DNA聚合酶 (T7 phage DNA polymerase) ? 持續(xù)合成能力最強(qiáng) ? 有 3’→5’ 外切酶活性是 Klenow酶的 1000。 ? 有 5’→3’ 外切酶活性。 六、反轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase, RTase) 反轉(zhuǎn)錄酶是依賴于 RNA的 DNA聚合酶，以 RNA為模板聚合cDNA鏈，具有 5′ →3 ′ 的 DNA聚合酶活性、 5′ →3 ′ 的 RNA外切核酸酶活性和 RNase H活性， 但缺乏 3′ →5 ′ RNA外切核酸酶活性，所以反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中無(wú)校正功能 。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 40 七、末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal deoxynucleotide transferase, TdT) 是不依賴于模板的 DNA聚合酶，催化 dNTP加于 DNA分子的 3’羥基端 。 ? 用途：體外合成 RNA分子作探針等。 T4 DNA連接酶的作用機(jī)制： ① ATP + DNA ligase (E)→ EAMP + PPi。 提高平頭末端連接效率的方法包括： ? 加大連接酶用量（ 10倍大于粘性末端的連接）。 三、 T4多核苷酸磷酸激酶（ T4PNP） 四、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase) 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 53 五、核酸酶（ Nuclease） BAL 31核酸酶 來(lái)源于交替單胞菌，從線性 DNA兩條鏈的 3’末端迅速去除單核苷酸，隨后從單鏈內(nèi)部發(fā)揮緩慢的內(nèi)切酶活性，形成截短的平末端雙鏈 DNA及以帶有 5個(gè)核苷酸突出單鏈的截短分子。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 57 核糖核酸酶 A（ ribonulease A或 RNase A） ? 為內(nèi)切核酸酶，可特異性攻擊 RNA上嘧啶殘基的 3’端，不需要 Mg2+，用于 DNA中 RNA的去除，使用前高溫加熱以去除 DNase。 外切酶核酸 Ⅲ 催化雙鏈 DNA的 3’羥基端逐一去除單核苷酸的反應(yīng)，用途廣泛，如 DNA截短、探針合成等。 七、瓊脂糖酶（ agarase） 可將瓊脂亞單位水解為新瓊脂寡糖，用于從低熔點(diǎn)瓊脂糖中分離純化大片段 DNA或 RNA分子。 本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容 ? 限制性核酸內(nèi)切酶的定義、命名、類型和末端屬性。 ? Klenow酶和 T4 DNA聚合酶的性質(zhì)及用途。
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