分子克隆工具酶 (2)-全文預覽
【正文】 定 DNA序列 三、 T4 DNA聚合酶 (T4 phage DNA polymerase) （ 1） T4 DNA酶的基本特性： ? 有 3’→5’ 的核酸外切酶活性和 5’→3 的 DNA聚合酶活性。 真核生物有 4種 DNA聚合酶： α、 β 、 γ 、線粒體型。 產(chǎn)生新的酶切位點 ：為依賴于甲基化的限制酶創(chuàng)造切點。 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 26 EcoKⅠ 甲基化酶 研究較少。 一些酶 對 Dam甲基化不敏感 ，如 BamHⅠ 、 SaU3AⅠ 、 BglⅡ 、PvuⅠ 等。 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 25 第二節(jié) 甲基化酶 一、甲基化酶的種類 原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（ methylase），又稱甲基轉移酶（ methyltransferase），大腸桿菌中有 3種。 ② 建立 DNA分子的限制酶圖譜 。 ③ 當切割大量 DNA時 ， 通常采用延長反應時間 ， 減少酶的用量 。 哺乳動物基因組中 CG序列只有隨機概率值的 1/5，且多數(shù)發(fā)生胞嘧啶甲基化， SmaⅠ 位平均約 65kb才出現(xiàn) 1次。 ? 采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質粒 DNA，可防止DNA的甲基化。 通過不同酶切末端的連接重組也可產(chǎn)生新的酶切位點 ， 對具體情況的分析在設計中有價值： 5’ 突出末端補平后重連； 同尾末端連接； 平末端連接 。 八 、 單鏈 DNA的切割 ? 多數(shù)限制酶很難切割單 DNA模板 。 ⑤ 含有機劑如乙醇 、 二甲基亞砜 、 二甲基乙酰胺等 。 ? 產(chǎn)生原因： ① 反應體系中甘油的濃度大于 5%。 多數(shù)限制酶的最佳反應溫度為 37℃ ，一部限制酶在 5065℃ 時最高效，少數(shù)在 2530℃ 時最理想。 應對辦法：超量用酶、延長切割時間。λ 噬菌體 DNA為 48502bp，兩端為 12bp粘性末端。 設計引物、接頭等時要考慮適當長度的保護堿基，載體構建時多克隆位點中的相臨位置的酶的切割序列的選擇也很重要。它們識別序列很長，核心識別序列一般為 1012bp，識別位點極少。 同裂酶（ isoschizomer）： 不同的酶識別序列相同，切割位點可以相同也可以不同，又分為同序同切酶、同序異切酶、同功多位酶和其它類型。 對稱型突出末端：回文結構決定對稱，分為 5’突出和 3’突出的粘性末端（ cohesive/sticky end）兩種。 限制酶的切割位置 ：多數(shù)在識別序列內(nèi)部，也有在外部、兩端、兩側或單側的。 ? Ⅱ 型限制酶用途大，多為同源二聚體，其中切口酶只在單鏈上產(chǎn)生切口， Ⅱs 型識別序列和切割位置特殊。 第二、三個字母 (小寫，斜體 )代表宿主菌種名 (species)。 ? 至 2022年 2月，共發(fā)現(xiàn) 3773種限制性內(nèi)切酶， I、 II、 III型各有 6 369 10種，甲基化指導的 3種，商品化的 609種， II型中共有 223種特異性。 ? 修飾 (modification)： 指寄主本身的 DNA，由于在合成后通過甲基化酶（ methylase） 的作用得以甲基化，使 DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。酶的切割位點可作為 DNA物理圖的特殊標記，利用限制性內(nèi)切酶可產(chǎn)生特定大小的 DNA片段并使純化這些 DNA片段成為可能，獲得的限制性 DNA片段可作為 DNA操作中的基本介質。 基因操作或遺傳工程的主要工具就是那些可在 DNA分子上催化特異性反應的酶。 限制作用實際就是限制性內(nèi)切酶 降解外源 DNA，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。 ? 起始于 20世紀 60年代對細菌的研究。 ? 堿基對（ base pair, bp） 限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則 ? 1973年 . Smith和 D. Nathams首次提出命名原則， 1980年 Roberts在此基礎上進行了系統(tǒng)分類 ① 限制性核酸內(nèi)切酶第一個字母（大寫，斜體）代表該酶的宿主菌屬名 (genus)。 例： EcoRⅠ 、 HindⅢ 、 SalⅠ 限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則： 屬名 種名 株名 Haemophilus influenzae strain d 流感嗜血桿菌 d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶 ? 據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 型三大類。 一些酶可識別多種結構尤其是允許一些堿基是簡并的， 還有一些酶識別序列呈間斷對稱，即回文對稱序列之間可以間隔一定長度的任意堿基。 ? Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈 DNA產(chǎn)生 3種不同的末端類型 。即使是單酶切限制片段在連接時也具有方向性。 例： XhoⅠ(C↓ TCGAG)與 SalⅠ(G↓ TCGAC)、 BamHI(G↓ GATCC)和 BglⅡ(A↓ GATCT) 歸位內(nèi)切酶（ homing endo
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