【正文】 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr 1. 天然質(zhì)粒的局限性 四、質(zhì)粒的構(gòu)建 20 21 ColE1 22 （ 1） 具有復(fù)制起點(diǎn)（ ori） 2. 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 （ 2）具有抗菌素抗性基因 （ 3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)： 是篩選的標(biāo)志。 23 （ 4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 26 ii）氯霉素（ chloramphenicol， Cml） 通過與 50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。 殺死細(xì)菌 。 b）細(xì)菌抗性原理 Strr 編碼一種 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體 30S亞基結(jié)合作用。 30 當(dāng)帶有 抗菌素抗性基因 的 載體 進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長。 而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù) 1000—3000個(gè)！ 適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。 34 （ 3）失控的質(zhì)粒載體 這是一類 溫度敏感型復(fù)制控制 質(zhì)粒。 35 （ 4） 插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。 直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。 注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。 42 （ 2）長度 4363bp （ 3）選擇標(biāo)記 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 獲得載體的寄主細(xì)胞 ? 在 Amp或 Tet其中之一 中死亡。 10kb的 DNA在純化過程中容易斷裂。 （ 7） PBR322的改進(jìn) 49 pBR325： 在 pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體 PICm的 HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因 cmlr）。 pUC pUC pUC pUCpUC1 pUC1 pUC19 51 ① 復(fù)制起點(diǎn) pBR322的 ori 但其上失去了克隆位點(diǎn)。 （ 4）選擇標(biāo)記 藍(lán)白斑選擇原理： ① Xgal （ 5Bromo4chloro3indolyl?Dgalactoside） 56 ?半乳糖苷酶 能把無色的化合物 X－gal分解成半乳糖和一個(gè) 深藍(lán)色 的物質(zhì) 5溴 4氯靛藍(lán)。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。能誘導(dǎo) lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的 lacZ 的 C端部分 和載體的 lacZ’?肽都表達(dá)。 MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。 ② 選擇方便 Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 與 pUC的主要區(qū)別是在 MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體 啟動(dòng)子 T7和 SP6。 2. pGEM4Z： 與 pGEM3Z相同，只是 T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的 位置互換 。 克隆、構(gòu)建 表達(dá) Animal cell ① 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá) 72 73 p A M 2 67 3 1 3 b pP G A L 1T 7 p r o m o t e rA m p i c i l l i nU R A 3f 1 o riS r P C S 1p U C o ri2 μ o r i g i nC Y C 1 T TB a m H I ( 1 9 7 7 )K p n I ( 5 1 2 )74 七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性 1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件： （ 1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次 （ 2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分 配到兩個(gè)子細(xì)胞中。 76 人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體 缺失了 par區(qū) ，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。 3. 分離的不穩(wěn)定性 （ segregation instability） 78 4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性 （ structural instability） 寄主基因組的 IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。 （ 2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù) 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。 （ 3）寄主菌的重組體系 二聚體災(zāi)難（ dimer catastrophe）： 含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。 T4 Bacteriophage 84 single linear DNA (about 182,000 bp) T2 Genomic DNA 85 86 噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。形成這一過程稱為溶源化（ lysogenization)。 95 三、單鏈?zhǔn)删w載體 iii) M1 f fd 噬菌體 單鏈環(huán)狀 DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體： M13 噬菌體 96 （ 2）復(fù)制型（ RF）是雙鏈環(huán)狀 DNA。 （ 1） +DNA。 M13噬菌體只感染 雄性 大腸桿菌。 （ 1）克隆區(qū)域的選定 ① 基因間隔區(qū)（ inter genic region, IG區(qū)） IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè) BsuI 切點(diǎn)。 利用 ?肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。 mG與 T配對(duì)，復(fù)制兩次后 5’ATGACCATGATTACGAATTCA EcoRI切點(diǎn) 用 EcoRI切 M13mp1 M13mp2 選擇能切開的 線性分子 再環(huán)化 M13mp1 107 ③ 對(duì) M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn) 在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（ MCS）。 雖無包裝限制，并非無限包裝！ 5. M13載體的缺點(diǎn) 115 6. 噬菌粒載體（ phagemid vectors） 由 質(zhì)粒載體 與 單鏈?zhǔn)删w載體 的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。 117 （ 2）常見的噬菌粒載體 噬菌粒載體 質(zhì)粒部分 單鏈?zhǔn)删w部分 輔助噬菌體 大腸桿菌寄主 pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18 pRSA101 ?VX M13 M13變異株 XS127，XS101 pUC118/pUC119 pUC18/ pUC19 M13 M13K07 MV1184 pBS pUC f1 M13K07 XL1Blue 輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。 121 來源于 M13的復(fù)制起點(diǎn)被 輔助噬菌體的基因 II產(chǎn)物控制。 2）包裝： 輔助噬菌體 外殼蛋白和 復(fù)制蛋白 噬菌粒載體 ssDNA 噬菌體 123 （ 4） pBluescript 噬菌粒載體（ pBS） Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。 1）定向體外轉(zhuǎn)錄 124 2）兩種復(fù)制模式 既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。 MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個(gè) 3’端突出的 T。 G. P. Smith1985年發(fā)明。 ?DNA兩端各有 12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為 cos位點(diǎn)。 2. ?噬菌體的基因組特點(diǎn) 146 A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII N COS COS 頭部基因 尾部基因 功能不明區(qū) 溶源化 重組 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌 生長非必須區(qū)段 cI基因：溶源過程控制基因。 152 這種多聯(lián)體分子必須在 cos位點(diǎn)被切斷成單體分子才能被包裝起來。 沒有外源 DNA插入的 ?載體感染受體菌形成混濁噬菌斑 。 感染 LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng) IPTG的誘導(dǎo)，利用 Xgal的顯色反應(yīng) 作選擇標(biāo)記。 158 1） ? EMBL4 ? EMBL4的可置換片斷內(nèi)部還有 Sal I酶切位點(diǎn)。 左臂 可置換區(qū) 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 160 可取代片斷中如果包含 LacZ’，可用Xgal顯色 作篩選標(biāo)記。 必須利用噬菌體外殼的作用！ （ 1）體外包裝： 164 165 ? 的 D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與 ? DNA 進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占 20%）。 ② 重組： 168 ③ 體外包裝的容量限制： 必須在正常野生型容量的 75%—105% （ 36—51kb） 之間。 （ 4） ?DNA載體的優(yōu)點(diǎn) 用在真核生物基因組文庫的建立。 ② 具有質(zhì)粒載體的特性： 大多帶有 pMB1或 ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。 （ 5） cosmid cloning ① 理論依據(jù)： cos位點(diǎn) : ?噬菌體的生命周期中，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)?DNA通過 cos位點(diǎn)連接的 “ 多聯(lián)體 ” 分子。 Ter體系： 包裝限制： 181 ① 用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物 DNA。 注入到細(xì)菌體內(nèi)的雜種 DNA分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式復(fù)制。 （ 7） cosmid載體克隆的缺點(diǎn) 用 堿性磷酸酶 除去線性質(zhì)粒片斷 5’端的磷酸，可防止載體自體連接。 （ 3）構(gòu)建原理：按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列。 細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn) ori和抗生素標(biāo)記Ampr （ 5）在酵母中的標(biāo)記基因 （ 6）在細(xì)菌中操作 197 4. YAC克隆外源 DNA URA3 TRP1 CEN4 198 （ 1）宿主酵母菌： 只有同時(shí)得到 YAC的 兩個(gè)臂 ，才能在基本培養(yǎng)基（不加 TRP和 URA）上生長。 （ 4）便于提純。 203 （ 1） OriS和 repE控制質(zhì)粒的單向復(fù)制。 （ 5） HindIII和 BamHI是插入位點(diǎn)。 205 反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu) 206 類似于真核細(xì)胞 mRNA 2. 反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu) env pol gag U3 U3 U5 U5 cap polyA 3’ 5’ LTR LTR R R ?+ Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV) 長末端重復(fù)序列。 LTR： 208 ?+：組裝時(shí)必需的非編碼序列 。 env pol gag U3 U3 U5 U5 cap polyA 3’ 5’ LTR LTR R R ?+ U U3： 5’段或 3’端獨(dú)特序列。 210 二、 DNA病毒載體 腺病毒（ adenovirus） 1. 腺病毒的基因組 線狀雙鏈 DNA病毒，基因組中有 14個(gè)基因。 （ 4）載體中的插入片斷可達(dá) （有包裝容量限制）。 212 3. 腺病毒載體 是目前最常用的基因治療載體之一。 213 含有 E1或 E3區(qū) 兩側(cè)的同源序列 。 一、基因打靶（ gene targeting） 基因敲出（ knockout） 基因敲入（ knockin） 218 二、基因打靶載體的要求 1. 要求能整合到染色體上特定的位置。 載體 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 載體 220 四、載體的整合方式 染色體 DNA HB1 染色體 DNA HB2 染色體 DNA 載體 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 載體 染色體 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 染色體 兩個(gè) tk基因 至少有一個(gè) 可能整合到基因組里。 222 五、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇 正 負(fù)選擇法： 1. 正選擇（ positive selection）： 用 G418進(jìn)行選擇。 223