【正文】 DNA 分子 (重組 DNA)。（ √ ） 三、 填空題 在 LacI 標記基因插入外源基因，經(jīng) IPTG 誘導，在 Xgal 培養(yǎng)基中顯 白 色，為 陽性 克隆，未插入基因的克隆顯 藍 色，為 陰 性克隆。 基因與載體的平末端連接方法有哪些 T4 連接酶連接法。 Klenow 酶在 有 dNTP 情況下，呈現(xiàn) DNA 聚合酶活性，在 沒有 dNTP 情況下呈現(xiàn)外切酶活性。 25．在基因工程中應(yīng)用的酶類統(tǒng)稱為 工具酶 。 文庫 ：是指某生物某一發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而成的克隆的集合。 又叫做基因拼接技術(shù)或 DNA重組技術(shù)。因此在構(gòu)建原核表達載體時必須有 1 個強的原核啟動子及 其兩側(cè)的調(diào)控序列。 ⑵ 雙向插入 經(jīng)單一限制核酸內(nèi)切酶（如 EcoRI）切割的目的基因和載體 , 因二者的粘性末端是相同的 , 因此在連接反應(yīng)中 , 目的基因可發(fā)生雙向插入 , 載體對目的基因表達是有方向的 , 而目的基因可雙向與之相連 , 這種連接若以克隆目的基因片段為目的沒有影響 , 若以表達為目的 , 我 們就要對插入的片段進行方向鑒定 , 因目的基因由起始密碼子向終止密碼子方向表達是定向轉(zhuǎn)錄的 , 一旦啟動子與目的基因編碼順序方向相反就不能正確轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA。 ？簡要或 圖示說明均可。 （ 2） 同聚物加尾法 運用末端核苷酰轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑?酸（通過脫氧核苷三磷酸前體）加到 DNA 分子單鏈延伸末端的 3’ OH 基因上 ,它并不需要模板鏈的存在 ,它一個一個加上核苷酸 ,構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴 ,長度可達 100 個核苷酸。 根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選 (1). 重組子大小鑒別篩選 重組子中因裝有一段較大分子量的外源基因 DNA, 因此其分子量明顯比原載體大得多 , 因此可從平板上挑取菌落分別提取重組載體（如質(zhì)粒重組子）和原載體（質(zhì)粒），無需用限制性內(nèi)切酶消化，直接進行凝膠電泳，攜帶外源性目的基因的重組子質(zhì)粒因分子量大，電泳遷移率較小 ，其電泳條帶在后，而原載體質(zhì)粒因分子量較小，電泳遷移率較大，其電泳條帶在前。 理論上的三大發(fā)現(xiàn)： ①證實了 DNA 是遺傳物質(zhì) ②揭示了 DNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復制機理 ③遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定 技術(shù)上的三大發(fā)明： ①限制核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與 DNA 切割 ② DNA 連接酶的發(fā)現(xiàn)與 DNA 片段的連接 ③ 基因工程載體的研究與應(yīng)用 ？ ⑴提高啟動子強度 ⑵縮短啟動子同克隆基因間距離 ⑶高效的翻譯起始序列 ⑷高效的轉(zhuǎn)錄終止區(qū) ⑸提高質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性 ⑹用以下方法提高翻譯水平：①調(diào)整 SD序列與 AUG間的距離②用點突變的方法改變某些堿基③增加 mRNA的穩(wěn)定性的 ⑺減輕細胞的代謝負荷：①誘導表達②表達載體的誘導復制 ⑻提高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表達融合蛋白②采用某種突變菌株③表達分泌蛋白質(zhì) ？ 優(yōu)點：大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，基礎(chǔ)生物學、分子遺傳學等方面的背景知識清楚，對其基因表達調(diào)控的分子機理也比較了解，而且歷經(jīng)二十年的基因工程實踐，大腸桿菌已發(fā)展成為一種安全的基因工程實驗體系，有多種適用的寄主菌株和載體系列，大 8 腸桿菌易于進行工業(yè)化批量生產(chǎn)。這種 lacZ 基因上缺失了一部分編碼序列的突變體與帶有這一部分編碼序列的突變 體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象叫α互補。 第三章 《細胞工程》復 習題 一、選擇題： 1．在動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較中，正確的是（ Ｂ ） A．結(jié)果是相同的 B．雜種細胞的形成過程基本相同 C．操作過程中酶的作用相同 D．誘導融合的手段相同 2. 單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和 B 淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（ C ） ①淋巴細胞 ②小鼠骨髓瘤細胞 ③ B 淋巴細胞自身融合細胞 ④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞 ⑤雜交瘤細胞 A． ②④ B．①③⑤ C． ①②③④ D．②③ 3．動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較中，正確的有 （ D ） A．誘導融合的方法完全相同 B．所用的技術(shù)手段完全相同 C．所采用的原理完全相同 D．都能形成雜種細胞 9 （ C ） A．單個骨髓瘤細胞增殖產(chǎn)生的抗體 B．單個 B 淋巴細胞增殖產(chǎn)生的抗體 C．單個雜交瘤細胞增殖產(chǎn)生的抗體 D．單個抗體通過克隆化，產(chǎn)生大量抗體 B 淋巴細胞 融合，可使融合的細胞經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體，其依據(jù)是（多選） （ AC ） A． B 淋巴細胞可以產(chǎn)生抗體，但不能無限增殖 B． B 淋巴細胞只有與骨髓瘤細胞融合后才能產(chǎn)生抗體 C．骨髓瘤細胞可以無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體 D．骨髓瘤細胞可以產(chǎn)生抗體，但不能無限增殖 B淋巴細胞進行無性繁殖，形成細胞群。 A、加大鹽的濃度 B、加活性炭 C、加大分裂素的濃度 D、加大生長素的濃度 （ B ）問題。但是不是生物體的每一個細胞都要包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。（ √ ） 16．單克隆抗體有產(chǎn)量高，特異性強，靈敏度高的優(yōu)勢，主要應(yīng)用在臨床診斷和作為藥物載體治療腫瘤 .（ √ ） 17．細胞核移植是指將一種細胞的細胞核轉(zhuǎn)移到另一種去掉了細胞核的細胞質(zhì)內(nèi)，然后將不同來源的細胞核和細胞質(zhì)融合 組成新的細胞。目前，植物體細胞雜交還有許多理論和技術(shù)問題沒有解決，如雜種植物還不能按照人們的需要表現(xiàn)出親代的優(yōu)良性狀，從遺傳學角度分析，其內(nèi)在因素很可能是 控制優(yōu)良性狀的基因還不能表達 。 12. 植物體內(nèi)的細胞為什么沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化成不同的組織器官，原因是 基因在特定時 間和空間條件下選擇性表達的結(jié)果 。 ： 也稱體細胞雜交，又叫無性雜交，是指利用現(xiàn)代科學技術(shù)，分別取出兩種生 物的單個細胞，然后使這兩種不同的生物細胞在同一培養(yǎng)器中，用無性的人工方法促使兩者互相凝集并發(fā)生細胞之間的融合，進而導致基因重組，產(chǎn)生能同時表達兩個親本細胞有益性狀的細胞雜交技術(shù)。 由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。 五、問答題： ?為什么？什么細胞的全能性最強 ？ 細胞的全能性是指生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能。科學家用植物組織培養(yǎng)的方法，已經(jīng)把許多種植物的離體的器官、組織或細胞，培養(yǎng)成了完整的植物體。 5．決定植物細胞脫分化、再分化的關(guān)鍵因素是什么 ? 影響脫分化的一個重要因素是植物激素。而后者需要在愈傷組織形成后，對其進行處理，形成分散的單個細胞，再誘導其分化出具有胚芽、胚軸、胚根的胚狀體，進而發(fā)育成完整植株。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種 B 淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的 B 淋巴細胞大量增殖。 （ 3）細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般 2～ 3 天甚至更短時間便可增加一倍。 ？ 動物細胞無細胞壁，多數(shù)動物細胞需附著在固體或半固體表面才能生長；動物細胞培養(yǎng)除了需要與微生物、植物細胞一樣的培養(yǎng)基成分外，還需要血清成分，特別需要動物激素的存在；動物細胞培養(yǎng)對環(huán)境更敏感，培養(yǎng)條件的控制更為嚴格；反應(yīng)器要適應(yīng)無菌狀態(tài)高密度、長時間培養(yǎng)。 細胞工程操作的主要對象有原核細胞如細菌、放射菌等細胞和真核細胞如酵母、動植物等細胞兩大類。 （ 4）培養(yǎng)時需要供氧，培養(yǎng)液粘度較大，不能耐受強力通風攪拌。 第四章 發(fā)酵工程復習題 一、選擇題： 氨酸，結(jié)果代謝產(chǎn)物沒有谷氨酸而產(chǎn)生乙酰谷氨酰胺，其原因是 （ ） A．溫度控制不適 B．通氣量過多 C. pH 呈酸性 ,正確的是（ B） A．青霉素是青霉菌生長代謝中重要的初級代謝產(chǎn)物 B．用紫外線、激光、化學誘變劑處理青霉菌再經(jīng)篩選的方法可以選育高產(chǎn)菌種 C．發(fā)酵罐接種后必須進行滅菌處理 D．在青霉菌生長的穩(wěn)定期，活菌數(shù)不再增加，青霉素產(chǎn)量也不再增加 ．錯誤的是（ B） A．組成酶是維持菌體基本生活的必要條件 B．菌 體能合成各種生長因子，不需要從外界補充 C．發(fā)酵液 pH 呈酸性時，就會生成乙酰谷氨酰胺 D．細胞膜透性的改變，可解除代謝產(chǎn)物對有關(guān)酶活性的抑制 （ D ） A 葡萄糖 B 蛋白胨 C NaCl D 維生素 ，但當葡萄糖濃度過高時，反而會抑制微生物的生長，原因是（ A ） A．碳源供應(yīng)太充足 B． 細胞會發(fā)生質(zhì)壁分離 C．改變了酵母菌的 pH 值 D．葡萄糖不是酵母菌的 原料 ，應(yīng)該是代謝旺盛、個體形態(tài)和生理特性比較穩(wěn)定的。 三、填空題： ； .微生物酶發(fā)酵；微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵；微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵；生物工程細胞發(fā)酵 ：發(fā)酵是在厭氧條件下進行，如 酒類發(fā)酵、酒精發(fā)酵、丙酮丁醇發(fā)酵、乳酸發(fā)酵；通風發(fā)酵：發(fā)酵是在通風條件下進行，如 酵母菌生產(chǎn)、抗生素發(fā)酵、有機酸發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵和酶制劑生產(chǎn)等。 17．發(fā)酵工程的主要內(nèi)容包括 生產(chǎn)菌種的選育 、 發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制 、 反應(yīng)器的設(shè)計 、 產(chǎn)物的分離、提取與精制 等。同時培養(yǎng)基也為微生物培養(yǎng)提供除營養(yǎng)外的其它所必須的條件。 ④ /所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。主要含有蔗糖，總糖可達 50%～75%。成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。誘導某些酶的產(chǎn)生 。 有機氮源是這些生長因子的重要來源 ？產(chǎn)物促進劑舉例？ 是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的 添加劑。如果補料過少 ,則使菌體過早進入衰退期，引起菌體衰老和自，同樣使生產(chǎn)力下降。從而改變細胞膜的透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進行。例如黑曲霉在 pH2~3 時發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在 pH 近中性時，則產(chǎn)生草酸。 目前發(fā)酵工程有按產(chǎn)品性質(zhì)分為五種類型： （ 1）微生物菌體發(fā)酵 （ 2）微生物酶制劑發(fā)酵 （ 3）微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵 （ 4）微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵 （ 5）生物工程細胞發(fā)酵 發(fā)酵工程包括哪些主要內(nèi)容？簡述微生物代謝產(chǎn)物類型。即 氧化還原酶； 轉(zhuǎn)移酶；水解酶； 裂合酶； 異構(gòu)酶； 合成酶（或稱連接酶） 。 細菌（大腸桿菌）；霉菌（黑曲酶；青酶；木酶；根酶）；放線菌（鏈酶菌）； 20 酵母等。 11. 酶的分離純化方法中，根據(jù)目的酶與雜質(zhì)分子大小差別有 凝膠過濾 法 ， 超濾 法和 超離心法三種。 15. 酶分子修飾中，經(jīng)過修飾的酶的 特性 會改變，即可 提高酶活力，增加穩(wěn)定性或降低抗原性 。 ．酶工程技術(shù)包括酶的 固定化 技術(shù)、酶的 修飾改造 技術(shù)、酶 反應(yīng)器 設(shè)計。 （ ╳ ） 酶的分類與命名的基礎(chǔ)是酶的專一性。 （ ╳ ） 膜分離過程中，膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆粒成分或分子通過，而把大于其孔徑的顆粒截留。（ √ ） 30．限制或固定于特定空間位置的酶是 DNA 連接酶（ ） 31．固定化細胞含有所需的胞內(nèi)酶（ √ ） 32．酶的提取和分離純化是指將酶從細胞或培養(yǎng)基中取出再與雜質(zhì)分開的過程（ √ ） 33．可通過分子修飾來改變已分離出來的天然酶結(jié)構(gòu)（ √ ） 21 34．酶固定化后可保 持酶穩(wěn)定催化特性，克服游離酶不足，并長時間反復使用，利于連續(xù)自動化生產(chǎn)（ √ ） 35． 生生 物物 傳傳 感感 器器 是是 利利 用用 生生 物物 活活 性性 物物 質(zhì)質(zhì) 做做 敏敏 感感 器器 件件 ， 配配 以以 適適 當當 的的 換換 能能 器器 所所 構(gòu)構(gòu) 成成 的的 分分 析析 檢檢 測測 工工 具具 。它涉及酶的發(fā)酵生產(chǎn)，酶的分離純化，酶分子修飾，酶的固定化，酶反應(yīng)動力學與反應(yīng)器，酶的應(yīng)用等方面。 mol 產(chǎn)物的酶量定義為 1 個酶活力單位?，F(xiàn)在，已知的酶都是由生物體合成的，除少數(shù)具有催化能力的 RNA 外，其化學本質(zhì)都是蛋白質(zhì)。 （ 3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好。 酶和菌體固定化的方法 酶和菌體固定化的方法很多。 2．包埋法 將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，稱為包埋法。 (1)離子鍵結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。 共價鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。主要的有重氮法、疊氮法、溴化氰法和烷化法等。兵中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。 酶的生產(chǎn)方法可分為提取法、發(fā)酵法以及化學合