【正文】 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 細胞學(xué)標記 ?染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點位臵等）和帶型（ C帶、 N帶、 G帶等）。第三代標記是位點極其豐富的單核苷 酸多態(tài)性 (SNP)。 ? DNA水平的多態(tài)性標記位點作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標，大大提高圖譜的 精確度、準確性?；蚪M內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個連鎖群。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳（ cR），限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為堿基對，即 DNA的長度。基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 第 二 章 遺傳圖譜 第一節(jié) 遺傳標記概述 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 遺傳作圖的標記 Set the flags on the genomes 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 一 、遺傳圖譜與物理圖譜 ?遺傳圖譜與物理圖譜 ?遺傳作圖 (geic mapping)：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它 DNA順序標定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。 ?物理作圖（ Physical mapping）：采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將 DNA分子標記、基因或克隆標定在基因組實際位臵。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 經(jīng)典遺傳圖譜 ?人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一個基 因組。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 現(xiàn)代遺傳圖譜 ? 70年代發(fā)展起來的 DNA重組技術(shù)、 80年代發(fā)展起來的分子標記技術(shù)為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使基因定位的方法從細胞及染色體水平過渡到分子水平。遺傳圖譜的第二代標記位點是大量的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（ VNTR)，包括微、小衛(wèi)星 (MS)或短串聯(lián)重復(fù) (STR 或 SSLP)。 ?特點： 直觀簡單 從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達、調(diào)控、個體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時難以反映基因型差異。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 *黑麥 (Secale cereale, 2n=14)染色體 Giemsa C帶 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 *常規(guī)染色技術(shù)與顯帶技術(shù)的結(jié)果 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 人類染色體端粒 DNA的熒光原位雜交照片 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 熒光標記探針檢測精子 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 生化標記 —— 貯藏蛋白、同工酶和等位酶 ?種子的貯藏蛋白： ?同工酶： ?等位酶： ? 優(yōu)點： 經(jīng)濟、方便、成本較低。 ?等位酶 (allozyme)： 由 一個位點 的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型。 ?狹義的分子標記概念只是指 DNA標記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納， 即現(xiàn)在通常所說的分子標記都是特指 DNA標記。 （ 3） 數(shù)量豐富 ， 多態(tài)性遍及整個基因組 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 第二類是 以聚合酶鏈式反應(yīng)（ Polymerase chain reaction ,簡稱PCR反應(yīng)）為核心的分子標記技術(shù) ，包括 ?隨機擴增多態(tài)性 DNA標記（ Random amplification polymorphism DNA, 簡稱 RAPD標記）； ? 簡單序列重復(fù)標記（ Simple sequence repeat, 簡稱 SSR標記）或簡單序列長度多態(tài)性（ Simple sequence length polymorphism, 簡稱 SSLP標記）； ?擴展片段長度多態(tài)性標記（ Amplified fragment length polymorphism, 簡稱 AFLP標記）； ?序標位（ Sequence tagged sites, 簡稱 STS標記）； ?序列特征化擴增區(qū)域（ Sequence charactered amplified region, 簡稱 SCAR標記）等。 ? 單核苷酸多態(tài)性（ SNP）標記等被稱為 第三代分子標記 。 1983年 Soller和Beckman最先應(yīng)用于品種鑒別和品系的純度的測定。 ?凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段 DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生 RFLP。 ?染色觀察： ?DNA提取 — 酶切 — 電泳 — 印跡 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 下列圖譜哪個是合適的酶切結(jié)果？？ 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?變性： ?脫嘌呤： mol/L中脫嘌呤， 10 min。 ? 雜交： 預(yù)雜交液中加入標記好的 marker和探針，放入雜交膜浸勻。臵 80℃ 超低溫冰箱中曝光過夜至 10天左右。 如： 水稻 RFLP探針可以在下列網(wǎng)頁獲?。? 玉米 RFLP探針可以在下列網(wǎng)頁獲?。? html 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?標記物：放射性和非放射性兩種 ?放射性： ?非放射性：生物素、地高辛素、熒光素 ? 放射性同位素標記： 靈敏度高，成本低 但操作不便，標記效率不太穩(wěn)定，壽命受半衰期限制 ? 非放射性標記（地高辛、生物素、熒光素等）： 安全，標記穩(wěn)定，探針壽命較長 但靈敏度較低，背景較高，成本高 ?32P、 35S和 3H ? RFLP探針的類 型 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?（ 1）隨機引物法 ?（ 2） 切口平移法 ?（ 3）末端標記法 ?（ 4）單鏈 DNA探針標記 ?（ 5） 寡核苷酸探針標記法 ? RFLP探針的 標記方法 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 探針標記 — 隨機引物法 ?25 ng變性 DNA ?5 uL 寡聚核苷酸 ?2 uL BSA ?3 uL [α 32P] dCTP ?2 uL Klenow酶 ?加水至 50 uL， 37℃ 中標記反應(yīng) 2 h。 ?缺點： ? DNA需要量較大，技術(shù)復(fù)雜。 ? Williams J G K et al, Nucl Acids Res, 1990(18):6531 ?其基本原理基于 PCR技術(shù)： ? RAPD標記技術(shù)就是用一個隨機引物（ 10個堿基左右）非定點地擴增基因組 DNA，然后用凝膠電泳分開擴增片段。不用時應(yīng) 20℃ 保存。 4種 dNTP濃度應(yīng)相同。一般出錯率為 2 104核苷酸 /每輪循環(huán)，利用 PCR克隆、測序時尤應(yīng)注意。 ?保存 : 在 20℃ 至少 6個月。通常 3755℃ 、 12分鐘。 ?PCR技術(shù) 是目前引用論文最多的技術(shù)，應(yīng)用范圍十分廣泛。 ?退火溫度低： RAPD引物短，因此退火溫度要低，一般為 3537℃ 。L Primer(10 pmol/L) 2 uL 10 Buffer 181。L dNTP（ 25 mmol/L） 181。 （ 2）所用材料不需有性世代，可用任何單一親本、任何部位的材料，在沒有有性世代的線粒體、葉綠體 DNA研究中也可使用； （ 3）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），一般不能鑒別雜合子和純合子。 省、快 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 六、 RAPD標記技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)?SCAR 標記技術(shù) ? SCAR 標記技術(shù)的原理： ? 序列特征化擴增區(qū)域（ Sequence charactered amplified region, 簡稱 SCAR標記）： ? SCAR標記是在 RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? SCAR 標記技術(shù)的操作步驟： ?RAPD擴增 ?回收特異 RAPD片段 ?PCR產(chǎn)物的克隆 ?獲得 SCAR標記 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 七、 RAPD標記實例： ?實例一 ： 親本中國春小麥、節(jié)節(jié)麥雙倍體和子代的 RAPD電泳圖譜 ? 引物為 S516: CTCTGCGCGT ?泳道 1為中國春小麥， ?泳道 二者的子代， ?泳道 3為節(jié)節(jié)麥。 ◆ 抗性植物對苯達松的解毒過程研究 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 水稻苯達松敏感致死基因的發(fā)現(xiàn) ?兩種水稻苯達松敏感致死突變體： 苯達松（ Bentazon）為一種苯并噻二唑類除草劑，普通水稻品種具有對 苯達松的抗性。 雜交稻制種需將不育系（母本）和恢復(fù)系（父本）分行種植，授粉靠人工趕粉，程序繁雜、勞動強度大。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 RAPD 分 析 使用美國 Operon公司編號為 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、I、 R、 S、 T、 U、 V、 W、 X、 Y、 Z系列引物，進行 RAPD分析，有 344個引物能擴增出 1～ 10余條不等肉眼可辨的譜帶，有 11個引物未能擴增出任何條帶，有 5個引物擴增結(jié)果彌散（ smear）。 RAPD多態(tài)性標記轉(zhuǎn)換成 SCAR標記 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 The sketch map of vector 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 Electrophoresis of plasmid DNA of rebinant digested with EcoR I Mλ DNA+EcoR I+Hind Ⅲ molecular marker。 ? 然后進行 高嚴謹退火 條件的循環(huán)，兩個位點間那些序列在低嚴謹度退火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴謹條件下擴增。 AP— PCR的缺點是每個新的多態(tài)性都必須經(jīng)純化才能進一步使用。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 小 結(jié)： ? RAPD、 APPCR和 DAF共同優(yōu)點： 在不需要知道所擴增 DNA序列情況下，產(chǎn)生 DNA 片段的指紋；需 DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。繼 RFLP之后的第二代分子標記。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 由于微衛(wèi)星 DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列，因此，可以根據(jù)其兩端序列的保守性，設(shè)計引物，進行 PCR，通過 PCR將其間微衛(wèi)星序列擴增出來，再電泳分離，染色顯帶以檢測微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。 三、 SSR的分布特點 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?不同物種重復(fù)單位及其頻率不同。在單子葉和雙子葉植物中 SSR數(shù)量和分布也有差異，平均分別為 kb和 kb中有一個 SSR。但隨著研究深入，證明并非如此。 ? 實驗 重復(fù)性好 ，結(jié)果可靠。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?相對的物種專一性； ?由于創(chuàng)建新的標記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，即 需建立基因文庫、克隆識別與篩選、測序等過程， 開發(fā)困難 ， 費用較高 ，耗時長；因此其開發(fā)有一定困難，費用也較高。