【正文】 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 第 二 章 遺傳圖譜 第一節(jié) 遺傳標(biāo)記概述 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 遺傳作圖的標(biāo)記 Set the flags on the genomes 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 一 、遺傳圖譜與物理圖譜 ?遺傳圖譜與物理圖譜 ?遺傳作圖 (geic mapping)：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它 DNA順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實(shí)驗(yàn)，家系分析。遺傳圖距單位為厘摩（ cM），每單位厘摩定義為 1％交換率。 ?物理作圖（ Physical mapping）：采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將 DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實(shí)際位臵。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種作圖的計(jì)算單位為厘鐳（ cR），限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為堿基對(duì)，即 DNA的長度。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?遺傳圖譜 (geic map) ?遺傳圖譜 (geic map)又稱遺傳連鎖圖譜或連鎖圖譜 (linkage map)。 經(jīng)典遺傳 學(xué)時(shí)代的遺傳連鎖圖譜主要是以家系分析或不同性狀個(gè)體間雜交為基礎(chǔ)，根據(jù)同源染色體上 等位基因的變化，通過 計(jì)算重組率 ，確定染色體上基因座位的順序和距離，構(gòu)建基因的連鎖圖譜。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 經(jīng)典遺傳圖譜 ?人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一個(gè)基 因組?；蚪M內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個(gè)連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染 色體上基因座位的順序和距離的確定，即主要通過家系分析，對(duì)不同性狀之間、性狀與標(biāo) 記之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的連鎖遺傳頻率進(jìn)行計(jì)算，最終繪制遺傳連鎖圖。 ?人類遺傳圖譜包括女性一種配子的 23條染色體 (記作 23，X)和男性兩種配子的 23條染色體 (23 ， X)、 (23， Y)上的所有基因位點(diǎn)。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 現(xiàn)代遺傳圖譜 ? 70年代發(fā)展起來的 DNA重組技術(shù)、 80年代發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使基因定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過渡到分子水平。 ? DNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，大大提高圖譜的 精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制也因此進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代。 ?現(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由 Botstein D等 (1980)首先提出的，在此基礎(chǔ)上，限制性片段長 度多態(tài)性 RFLP作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問世 。遺傳圖譜的第二代標(biāo)記位點(diǎn)是大量的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（ VNTR)，包括微、小衛(wèi)星 (MS)或短串聯(lián)重復(fù) (STR 或 SSLP)。第三代標(biāo)記是位點(diǎn)極其豐富的單核苷 酸多態(tài)性 (SNP)。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 形態(tài)標(biāo)記 ?遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征 —— 遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。 如穗形、芒長、穗長、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。 ?特點(diǎn)： 直觀簡(jiǎn)單 從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個(gè)體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時(shí)難以反映基因型差異。 二、遺傳標(biāo)記的 種類 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 ?染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位臵等）和帶型（ C帶、 N帶、 G帶等）。 隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。 ?特點(diǎn)： 直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 *黑麥 (Secale cereale, 2n=14)染色體 Giemsa C帶 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 *常規(guī)染色技術(shù)與顯帶技術(shù)的結(jié)果 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 人類染色體端粒 DNA的熒光原位雜交照片 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 熒光標(biāo)記探針檢測(cè)精子 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 生化標(biāo)記 —— 貯藏蛋白、同工酶和等位酶 ?種子的貯藏蛋白： ?同工酶： ?等位酶： ? 優(yōu)點(diǎn)： 經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低。 ? 缺點(diǎn)： 結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 同工酶與等位酶 ?同工酶 (isozyme)： 由 一個(gè)以上 基因座位編碼的酶的不同形式。催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)本身的分子結(jié)構(gòu)組成有所不同的一組酶。 ?等位酶 (allozyme)： 由 一個(gè)位點(diǎn) 的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型。 ?電泳可區(qū)分 同一種酶（系統(tǒng)）的不同變化 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 材料的采集 研磨和酶的提取 酶的保存 淀粉凝膠制備 電泳 凝膠切片 酶的組織化學(xué)染色 酶譜的記錄與分析 數(shù)據(jù)分析 同工酶和等位酶分析的程序 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 夏臘梅 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 夏臘梅同工酶譜照片 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 分子標(biāo)記 ?廣義的分子標(biāo)記 (molecular marker)是指可遺傳的并可檢測(cè)的 DNA序列或蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。 ?狹義的分子標(biāo)記概念只是指 DNA標(biāo)記，而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納， 即現(xiàn)在通常所說的分子標(biāo)記都是特指 DNA標(biāo)記。 它能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的 DNA片段，它直接反映基因組 DNA間的差異。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?分子標(biāo)記的特點(diǎn) 本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記 ， 一般特點(diǎn)： （ 1） 以 DNA的形式表現(xiàn) ， 在生物體的各個(gè)組織 、 各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到 ， 不受季節(jié) 、 環(huán)境限制 ， 不存在表達(dá)與否等問題 。 （ 2） 多態(tài)性高 ， 自然界存在許多等位變異 ， 無須人為創(chuàng)造 。 （ 3） 數(shù)量豐富 ， 多態(tài)性遍及整個(gè)基因組 。 （ 4） 表現(xiàn)為 “ 中性 ” ， 不影響目標(biāo)性狀的表達(dá) ， 與不良性狀無必然的連鎖 。 （ 5）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 遺傳標(biāo)記（ geic marker） 具有多型性 易于鑒別 與目標(biāo)基因緊密連鎖 ? 性狀標(biāo)記 色澤， 形態(tài) … ? 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 倒位，易位， G/N/C帶 … ?生化標(biāo)記 同功酶 … ? 分子標(biāo)記 RFLP、 RAPD、 SSR、 AFLP、SNP… … 基礎(chǔ) 基因表達(dá)結(jié)果 表現(xiàn)型 DNA堿基 序列變異 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 三、分子標(biāo)記的種類 ?第一類是以 分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù) ，包括： ?限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（ Restriction fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱 RFLP標(biāo)記）； ?DNA指紋技術(shù)（ DNA Fingerprinting）； ?原位雜交（ in situ hybridization）等。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? 第二類是 以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ Polymerase chain reaction ,簡(jiǎn)稱PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù) ，包括 ?隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA標(biāo)記（ Random amplification polymorphism DNA, 簡(jiǎn)稱 RAPD標(biāo)記）； ? 簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（ Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱 SSR標(biāo)記）或簡(jiǎn)單序列長度多態(tài)性（ Simple sequence length polymorphism, 簡(jiǎn)稱 SSLP標(biāo)記）； ?擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（ Amplified fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱 AFLP標(biāo)記）； ?序標(biāo)位（ Sequence tagged sites, 簡(jiǎn)稱 STS標(biāo)記）； ?序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（ Sequence charactered amplified region, 簡(jiǎn)稱 SCAR標(biāo)記）等。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?第三類是 一些新型的分子標(biāo)記 ，如： ?單核苷酸多態(tài)性（ Single nuleotide polymorphism, 簡(jiǎn)稱 SNP標(biāo)記）； ?表達(dá)序列標(biāo)簽（ Expressed sequences tags, 簡(jiǎn)稱 EST標(biāo)記）等。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? DNA分子標(biāo)記的主要類型 依其所用的分子生物學(xué)技術(shù)大致可以分為： ? 一類是以 Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如 RFLP），這類分子標(biāo)記被稱為 第一代分子標(biāo)記 。 ? 一類是以 PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如 STS、RAPD、 AFLP、 SSR）等，這類分子標(biāo)記被稱為 第二代分子標(biāo)記 。 ? 單核苷酸多態(tài)性（ SNP）標(biāo)記等被稱為 第三代分子標(biāo)記 。它也是以以 PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 第二節(jié) 限制性片段長度多態(tài)性 標(biāo)記技術(shù) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?該技術(shù)由 Grodzicker等于 1974年創(chuàng)立。 1980年由 Botstein再次提出。 1983年 Soller和Beckman最先應(yīng)用于品種鑒別和品系的純度的測(cè)定。 ?自從人的 RFLP圖譜構(gòu)建后，已經(jīng)分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的RFLP圖譜。 ?一、 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)標(biāo)記技術(shù)的原理 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?特定生物類型的基因組 DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會(huì) 產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段 ，或稱限制性等位片段。 ? RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是 通過電泳的方法分離和檢測(cè)這些片段 。 ?凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段 DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生 RFLP。 即：物種的基因組 DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的 DNA作探針，把與被標(biāo)記 DNA相關(guān)的片段檢測(cè)出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 EcoRⅠ 酶切示意圖 A sample : 5‘ AGGAATTCGAATTCGAATTCCG