【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ation ? dNTPs： 貯備 dNTP液 ： 1 mol/L NaOH 調(diào) pH至中性。貯備濃度為 510mmol/L，終濃度為 20200 umol/L，分裝 20℃保存。 4種 dNTP濃度應(yīng)相同。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? Taq DNA polymerase： from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus. other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications. 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?Taq DNA聚合酶特性： ?分離 : 1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉。 ?分子量 : 94KDa ?活性： 在幾種水生棲熱菌中活性最高， 202200U/mg ?離子需要： 對(duì) Mg2+、 單價(jià)離子性質(zhì)和濃度較 敏感。最適濃度為 50mmol/L ?忠實(shí)性 : 沒(méi)有校正單核苷酸錯(cuò)配功能 致命弱點(diǎn)。一般出錯(cuò)率為 2 104核苷酸 /每輪循環(huán)，利用 PCR克隆、測(cè)序時(shí)尤應(yīng)注意。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?抑制劑 : 尿素、乙醇、 DMSO、 DMF、甲酰胺、 SDS 及許多其他化學(xué)藥劑。 ?內(nèi)源 DNA: 不同來(lái)源的酶可能由于制備過(guò)程中殘留的原細(xì)菌 DNA或 PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來(lái)源的 DNA。在使用擴(kuò)增保守序列的通用引物時(shí)，會(huì)在無(wú)模板對(duì)照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。 ?保存 : 在 20℃ 至少 6個(gè)月。 ?Taq DNA聚合酶特性： 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?Selection for DNA polymerase Klenow酶 早期采用 該酶不耐熱，缺點(diǎn)有 : ① 溫度要求低 (37℃) ，受熱即失活； ②產(chǎn)物特異性不高； ③積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低； ④擴(kuò)增的最長(zhǎng)序列約 400bp（ Taq酶則能擴(kuò)增 10kb） 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?thermostable DNA polymerases ① Taq DNA polymerase ② Tth DNA polymerase— from ③ VENT DNA polymerase— from ④ Sac polymerase ⑤ pfu polymerase 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? mineral oil 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? PCR optimization ?變性溫度和時(shí)間 9295℃ ，富含 G和 C的序列，可適當(dāng)提高，但過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失。 ?退火溫度與時(shí)間 引物中 G、 C含量高、 長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常 3755℃ 、 12分鐘。 ?延伸溫度和時(shí)間 溫度： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ 時(shí)間：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時(shí)間。 ?循環(huán)次數(shù) 循環(huán)過(guò)多，非特異性產(chǎn)物大量增加 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?PCR技術(shù) 發(fā)展速度驚人，沒(méi)有一種技術(shù)能與之相比。 ?PCR技術(shù) 是目前引用論文最多的技術(shù)，應(yīng)用范圍十分廣泛。 ?PCR 技術(shù) 1993 年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)（ Mullis），與開(kāi)創(chuàng)了 “ 寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變 ” 加拿大籍英國(guó)科學(xué)家 Michael Smith共獲 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 三、 RAPD技術(shù)與常規(guī) PCR不同的地方： ?引物長(zhǎng)度短： 常規(guī) PCR中需要兩個(gè)引物，長(zhǎng)度 2030個(gè)核苷酸。 RAPD只需一個(gè)引物，長(zhǎng)度 910個(gè)核苷酸，而且是隨機(jī)引物。 ?退火溫度低： RAPD引物短，因此退火溫度要低，一般為 3537℃ 。 ?擴(kuò)增結(jié)果可以是 1至多條帶 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? RAPD標(biāo)記與常規(guī) PCR擴(kuò)增的結(jié)果 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 四、 RAPD標(biāo)記技術(shù)的操作 ? PCR反應(yīng)： DNA（ 20 ng/181。L） 1 181。L Primer(10 pmol/L) 2 uL 10 Buffer 181。L Mg2+（ 15 mmol/L） 181。L Taq酶（ 5 U/181。L） 181。L dNTP（ 25 mmol/L） 181。L 加水至 20181。L (再加入石臘油 )，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 Step1 94 ℃ 5 min Step2 94 ℃ 60 sec Step3 36℃ 60 sec Step4 72℃ 90 sec Step5 GO TO Step24 3540 cycles Step6 72℃ 5 min Stored in below 4 ℃ freezer ? PCR擴(kuò)增程序： 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 五、 RAPD標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn) （ 1）不需 DNA探針，設(shè)計(jì)引物不需先知道基因組的任何分子信息，無(wú)須知道序列信息。引物沒(méi)有嚴(yán)格的種屬界限，同一套引物可用于任何一種植物的研究，具有 廣泛性 和 通用性 。 （ 2）所用材料不需有性世代，可用任何單一親本、任何部位的材料，在沒(méi)有有性世代的線粒體、葉綠體 DNA研究中也可使用； （ 3）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），一般不能鑒別雜合子和純合子。 （ 4）實(shí)驗(yàn)步驟少，技術(shù)簡(jiǎn)便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。 （ 5） DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低。 （ 6） 缺點(diǎn)：大多顯性遺傳，一般不能鑒別雜合子和純合子；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 省、快 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 六、 RAPD標(biāo)記技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)?SCAR 標(biāo)記技術(shù) ? SCAR 標(biāo)記技術(shù)的原理： ? 序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（ Sequence charactered amplified region, 簡(jiǎn)稱 SCAR標(biāo)記）： ? SCAR標(biāo)記是在 RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。 SCAR標(biāo)記是將目標(biāo) RAPD 片段進(jìn)行克隆并對(duì)其末端測(cè)序，根據(jù) RAPD 片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)基因 DNA 片段再進(jìn)行 PCR特異擴(kuò)增，把與原 RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來(lái)。 ? SCAR 標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)： SCAR標(biāo)記是 共顯性 遺傳，待檢 DNA 間的差異可直接通過(guò)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)顯示。 SCAR標(biāo)記方便、快捷、 可靠 ，可以快速檢測(cè)大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? SCAR 標(biāo)記技術(shù)的操作步驟： ?RAPD擴(kuò)增 ?回收特異 RAPD片段 ?PCR產(chǎn)物的克隆 ?獲得 SCAR標(biāo)記 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 七、 RAPD標(biāo)記實(shí)例： ?實(shí)例一 ： 親本中國(guó)春小麥、節(jié)節(jié)麥雙倍體和子代的 RAPD電泳圖譜 ? 引物為 S516: CTCTGCGCGT ?泳道 1為中國(guó)春小麥， ?泳道 二者的子代， ?泳道 3為節(jié)節(jié)麥。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?實(shí)例二： RAPD擴(kuò)增克隆魚(yú) (B)、供體紅鯉 (A)、受體金魚(yú) (D)和雜交魚(yú) (C，即 A♂ xD♀ )的細(xì)胞核 DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示，對(duì)于不同的引物，克隆魚(yú)的擴(kuò)增譜帶均和供體紅鯉的一致，迥異于受體金魚(yú)和雜交魚(yú)。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 實(shí)例三： 水稻苯達(dá)松敏感致死基因的RAPD標(biāo)記和 SCAR標(biāo)記 —— (本課題組的部分工作 ) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 1 、苯達(dá)松對(duì)植物的作用 苯達(dá)松為一種選擇性、輸導(dǎo)型除草劑，其作用靶標(biāo)是光合系統(tǒng) Ⅱ ，抑制植物光合作用電子傳遞。 ◆ 抗性植物對(duì)苯達(dá)松的解毒過(guò)程研究 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 水稻苯達(dá)松敏感致死基因的發(fā)現(xiàn) ?兩種水稻苯達(dá)松敏感致死突變體： 苯達(dá)松（ Bentazon）為一種苯并噻二唑類除草劑，普通水稻品種具有對(duì) 苯達(dá)松的抗性。 1984年，日本 Mori k ， 農(nóng)林 8號(hào) 60Coγ射線 農(nóng)林 8號(hào) m 1999年，中國(guó)張集文等， W6154S 60Coγ射線 8077S(M8077S) ? Mori K、陳忠明等、張集文等通過(guò)遺傳學(xué)分析表明：兩種不同來(lái)源的苯達(dá)松敏感致死基因均為核控制的隱性單基因。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 克隆該基因的意義 ? 利用雜種優(yōu)勢(shì)是大幅度提高農(nóng)作物產(chǎn)量的重要途徑。雄性不育是雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，但在雜交水稻制種和生產(chǎn)過(guò)程中，存在 兩大障礙 ： 雄性不育系易受環(huán)境溫度的影響而出現(xiàn)育性不穩(wěn)定。 雜交稻制種需將不育系（母本）和恢復(fù)系（父本）分行種植，授粉靠人工趕粉，程序繁雜、勞動(dòng)強(qiáng)度大。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?水稻苯達(dá)松敏感致死性狀作為一種化學(xué)致死標(biāo)記，由單個(gè)隱性核基因控制，因此，它在雜交稻生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。其 利用價(jià)值表現(xiàn)在： 轉(zhuǎn)育不育系，保證雜交水稻種子純度。 轉(zhuǎn)育恢復(fù)系，革新雜交水稻制種方法。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 RAPD 分 析 使用美國(guó) Operon公司編號(hào)為 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、I、 R、 S、 T、 U、 V、 W、 X、 Y、 Z系列引物，進(jìn)行 RAPD分析，有 344個(gè)引物能擴(kuò)增出 1～ 10余條不等肉眼可辨的譜帶，有 11個(gè)引物未能擴(kuò)增出任何條帶，有 5個(gè)引物擴(kuò)增結(jié)果彌散（ smear）。最終有 5個(gè)引物 OPT1 OPF0 OPG1OPE0 OPD10在農(nóng)林 8號(hào)和農(nóng)林 8號(hào) m之間擴(kuò)增出 7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，分別記作 OPT15/1100、 OPF03/1700、OPF03/119 OPG18/94 OPG18/97 OPE09/1900、OPD10/1248，這 7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記 經(jīng) 3次重復(fù)結(jié)果穩(wěn)定一致。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 RAPD markers between Norin8 and Norin 8 m ( Polymorphic fragments noticed with arrows MλDNA+EcoR I+Hind Ⅲ DNA marker) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 OPT15/1100、 OPF03/1700、 OPF03/119OPG18/943為農(nóng)林 8號(hào) m所特有的譜帶，OPG18/97 OPE09/1900、 OPD10/1248為農(nóng)林 8 號(hào)所特有的譜帶，其中引物 OPG18在農(nóng)林 8號(hào)和農(nóng)林 8號(hào) m之間分別擴(kuò)增出多態(tài)性標(biāo)記OPG18/972和 OPG18/943， OPF03在農(nóng)林 8 號(hào) m 中擴(kuò)增出 2 個(gè)多態(tài)性標(biāo)記 OPF03/1700和OPF03/1198。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 7個(gè) RAPD多態(tài)性標(biāo)記經(jīng)純化，連接到質(zhì)粒載體 ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 InVαF′，在LB