生物技術藥物質(zhì)量控制-預覽頁
【正文】 給藥法 (曲線穩(wěn)定后對倍增加樣品濃度為： 105～ 102 RU計算對照品和各實驗樣品的半效稀釋倍數(shù)， 按下式計算樣品效價：樣品效價 =對照品效價 樣品半效稀釋倍數(shù)／對照品半效稀釋倍數(shù) 生物學活性測定方法選擇 體內(nèi)測定和體外測定方法 a、體內(nèi)測定：即整體動物測定，能為較大范圍的重組產(chǎn)品的效價提供有用信息，但費時、昂貴、難操作及同時存在倫理問題，大多數(shù)情況下傾向于選擇體外測定方法。 細胞培養(yǎng)法中細胞染色標記方法 3Hthymidine、 BrdU 是反映 DNA合成、增殖細胞 數(shù)的比例的。 Crystal violet：染活細胞后，在比色計中測定光吸收值（ A）， A值與著染色細胞數(shù)成正比。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構不能常規(guī)測定，而它的改變（如二硫鍵的錯誤配對）可影響蛋白質(zhì)的生物學活性，從而影響藥效，比活性可以反映此種情況。 對于成品的生物活性測定標準，要根據(jù)不同方法的特點規(guī)定相當標示量的范圍，目前，生物活性的測定方法有四類：動物基礎、細胞基礎、生化（酶）法、特異（免疫、受體）結(jié)合法。 按 WHO規(guī)定必須用 HPLC和非還原 SDSPAGE兩種方法測定，其純度都應達到 95%以上，有的甚至要求達到 99%以上。蛋白質(zhì)樣品在荷質(zhì)比均一。 + 分析方式 紫外、熒光、折射 紫外（可見、熒光） 同 HPLC 電化學、放射性 銀染、放射自顯影 儀器價格 中～高 低 中～高 日常消耗 低 高 低 自動化 中～高 低 中～高 人力操作 低 高 低 制備級 中 中 微量級制備 收集樣品 可以 可以 較困難 用于研究蛋白質(zhì)純度的方法和機制 方法 分析機制 反相 HPLC 疏水性 疏水性相互作用 HPLC 疏水性 毛細管電泳 荷質(zhì)比 離子交換 HPLC 電荷 等電聚焦 電荷 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電荷比 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 電荷，分子大小 分子排阻 HPLC 分子大小 質(zhì)譜測量法 分子大小 三、蛋白質(zhì)含量測定 此項目主要用于原液比活性計算和成品規(guī)格的控制。 相對分子質(zhì)量測定 ? 還原型 SDSPAGE：蛋白質(zhì)在 SDS和 β 巰基乙醇存在下沸水浴 5min，形成表面帶大量負電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過程中蛋白遷移率基本只與其相對分子質(zhì)量相關。 肽圖分析 ? 肽圖 分析可作為與天然產(chǎn)品或參考品的蛋白質(zhì)一級結(jié)構做精密比較的手段。 ?在生產(chǎn)工程中每批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應當一致。 N末端和 C末端氨基酸測序 ?作為重組蛋白質(zhì)和肽的重要鑒別指標，一般要求至少測定 N末端 15個氨基酸、C末端 1～ 3氨基酸。 七、殘余雜質(zhì)檢測 對殘余雜質(zhì)進行限制的意義 a、殘余雜質(zhì)可能具有毒性，引起安全性問題； b、可能影響產(chǎn)品的生物學活性和藥理作用，或使產(chǎn)品變質(zhì)； c、反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。 來自 %；來自 CHO細胞的產(chǎn)品為 不大于 %。 安全性及其他檢測項目 ?無菌試驗 ?熱源試驗 ?異常毒性試驗 ?免疫原性檢查 ?水分、裝量、 pH檢測 生物技術藥物待測樣品保存 ? 生物技術藥物大多為具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽，易受環(huán)境條件的影響。對于理化測定方法已有了確定的要求和判定標準，而生物學測定的結(jié)果具有更大的可變性，一般要使用動物或細胞，這些有機體本身就具有較大的可變性，因此生物學測定的要求和合格標準要松一些。 直線性（ linearity） 是測定結(jié)果與樣品中測試物濃度的線性關系，該參數(shù)的測定將確定檢測方法的測量范圍，它可以表示為回歸直線的斜率和離散性，或者相關系數(shù) R和測定系數(shù) R2 。一般采用填加和回收試驗來測定準確性，即將已知量的樣品加到空白中進行測定，比較測定值與真實值之比。 精密性（ precision） 表示測定值之間的一致性或接近的程度，一般表示為變異系數(shù) (CV%)，變異系數(shù)即是測定值的標準差與測定值的比值。 測定限度（ Limit of Detection） 是指能夠測定出的樣品中 測試物 的最低量。 耐用性（ robustness/ruggedness） 是通過有效地改變實驗方法的參數(shù)，來測定此改變對試驗結(jié)果的影響，即實驗結(jié)果不受影響的承受程度。這是由于它們相對于對照品的測定時間不一樣而造成的。 幾種生物技術藥物檢驗項目表 IFNα2b 原液 蛋白含量 宿主菌蛋殘留量 ≤ 總蛋白質(zhì)的 % 等電點 ～ 鼠 IgG含量 ≤ 100 ng/劑量 電泳純度 ≥ %分子量 1
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