細(xì)胞生物學(xué)研究方法(1)-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn) 。 （五）相差顯微鏡 原理 用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本 （六）偏光顯微鏡 polarizing microscope ? 用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì) ， 如纖維絲 、 紡錘體 、 膠原 、 染色體等 。 標(biāo)本可略厚一點(diǎn) ， 折射率差別更大 ， 故影像的立體感更強(qiáng) 。 二、電子顯微鏡 （ 一）透射電子顯微鏡 transmission electron microscope, TEM ? 以電子束作光源 ， 電磁場(chǎng)作透鏡 。 ? 用于觀察超微結(jié)構(gòu) （ ultrastructure） ， 即小于 、 光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的結(jié)構(gòu) ， 又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（ submicroscopic structures） 。 Negative Stained Actin 3）冰凍蝕刻 freezeetching ? 亦稱冰凍斷裂 。 然后將組織溶掉 ， 把碳和鉑的膜剝下來(lái) ， 此膜即為復(fù)膜 （ replica） 。 ? 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。 ? 用途：三態(tài) （ 固態(tài) 、 液態(tài)和氣態(tài) ） 物質(zhì)均可進(jìn)行觀察 。 – 細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史 ， Gordon等人 （ 1962） 對(duì)非洲爪蟾進(jìn)行核移植獲得成功 。 2. 化學(xué)固定：如甲醇 、 乙醇 、 丙酮 、 甲醛 、 戊二醛和鋨酸等試劑 。 用于顯示糖和脫氧核糖核酸 （ Feulgen反應(yīng) ） 。 5. 茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì) 。 ? 酶標(biāo)免疫法 （ enzymelabeled antibody method） ：常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶 ， 酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物 ， 從而顯示出抗原存在的部位 。 ? 原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi) ， 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后 ， 制取切片 ， 涂上鹵化銀乳膠 ， 經(jīng)放射性曝光 ，使乳膠感光 。 五、分子雜交技術(shù) ? 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段 ， 在適當(dāng)條件下 ， 通過(guò)氫鍵結(jié)合 ， 形成 DNADNA， DNARNA或RNARNA雜交的雙鏈分子 。 最初是使用帶放射性的 DNA探針 ， 后來(lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)?。 ? 反應(yīng)體系：①樣品 DNA；②引物（ primer），約 1520個(gè)核苷酸；③ 4種 dNTP；④ Tag DNA聚合酶，來(lái)自于嗜熱水生菌 Thermus aquaticus，最適作用溫度 75~80℃ ，短時(shí)間在 95℃ 下不失活。 ? 轉(zhuǎn)速為 10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī) 。 ? 用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器 。 ? 類(lèi)型：速度沉降 、 等密度沉降 。 ? 特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低 ， 介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度 。 – 所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大 10~100倍 ， 往往需要高速或超速離心 。 包被細(xì)胞的液流稱為鞘液 ， 所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì) （ flow cytometer） 。 第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交 一、細(xì)胞培養(yǎng) （一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) ? 群體培養(yǎng) （ mass culture） ：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中 ， 讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng) ， 匯合 （ confluence） 后形成均勻的單細(xì)胞層； ? 克隆培養(yǎng) （ clonal culture） ：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液 ，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng) ， 每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落 ， 稱為克隆 。 ? 細(xì)胞系 （ cell line） ：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 ， 可無(wú)限繁殖 。用于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無(wú)性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。 Plant Cell Culture Animal Cell Culture 二、細(xì)胞融合 ? 通過(guò)培養(yǎng)和介導(dǎo) ， 兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程稱為細(xì)胞融合 （ cell fusion） 或細(xì)胞雜交 。 ? 誘發(fā)融合： 異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合 。
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