細(xì)胞生物學(xué)研究方法(1)(已改無錯(cuò)字)
2023-02-16 21:11:41 本頁面
【正文】 具有互補(bǔ)關(guān)系 。 ? （ 一 ） 原位雜交 （ in situ hybridization） 。 ? 用于檢測(cè)染色體上的特殊 DNA序列 。 最初是使用帶放射性的 DNA探針 ， 后來又發(fā)明了免疫探針法 。 （二） Southern雜交 ? 是體外分析特異 DNA序列的方法 ， 操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核 DNA或線粒體 DNA切成 DNA片段 ，經(jīng)凝膠電泳分離后 ， 轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上 ， 再用探針雜交 ， 通過放射自顯影 ， 即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列 。 ? 將 RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上 ， 用探針雜交 ， 則稱為Northern雜交 。 六、 PCR 技術(shù) ? PCR即： polymerase chain reaction。 ? 反應(yīng)體系：①樣品 DNA；②引物（ primer），約 1520個(gè)核苷酸；③ 4種 dNTP；④ Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌 Thermus aquaticus，最適作用溫度 75~80℃ ，短時(shí)間在 95℃ 下不失活。⑤緩沖體系和 Mg2+。 ? 反應(yīng)過程：①變性：約 9095℃ ；②復(fù)性：約 60℃ 左右；③延伸： 7075℃ ；④重復(fù) “變性 ——復(fù)性 ——延伸” 過程 2030次循環(huán)。 PCR原理 第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù) 一、離心技術(shù) ? 是分離細(xì)胞器 （ 如細(xì)胞核 、 線粒體 、 高爾基體 ） 及各種大分子基本手段 。 ? 轉(zhuǎn)速為 10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī) 。 ? 轉(zhuǎn)速 25kr/min， 離心力 89Kｇ者稱為超速離心機(jī) 。 ? 目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá) 100000r/min， 離心力超過 500Kg。 （一）差速離心 Differential centrifugation ? 特點(diǎn)： – 介質(zhì)密度均一； – 速度由低向高 ， 逐級(jí)離心 。 ? 用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器 。 ? 沉降順序：核 ——線粒體 ——溶酶體與過氧化物酶體 ——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體 ——核蛋白體 。 ? 可將細(xì)胞器初步分離 ， 常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化 。 Low speed High speed Differential centrifugation （二）密度梯度離心 ? 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度 ， 將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部 ， 通過離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層 、 分離 。 ? 類型：速度沉降 、 等密度沉降 。 ? 常用介質(zhì)：氯化銫 、 蔗糖 、 多聚蔗糖 。 ? 分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求： – 1） 能產(chǎn)生密度梯度 ， 且密度高時(shí) ， 粘度不高； – 2） PH中性或易調(diào)為中性； – 3） 濃度大時(shí)滲透壓不大； – 4） 對(duì)細(xì)胞無毒 。 速度沉降 velocity sedimentation ? 用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器 。 ? 特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低 ， 介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度 。 ? 原理：介質(zhì)密度梯度平緩 ， 分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離 。 isopyic sedimentation ? 用途：分離密度不等的顆粒 。 ? 特點(diǎn)： – 介質(zhì)密度較高 ， 陡度大 ， 介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度 。 – 所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大 10~100倍 ， 往往需要高速或超速離心 。 ? 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處 ， 并停留在那里達(dá)到平衡 ， 從而將不同密度的成分分離 。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 二、流式細(xì)胞術(shù) ? 用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 快速定量分析與分選 的一門技術(shù) 。 ? 原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴 ， 形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴 ， 在激光束的照射下 ， 這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光 ， 經(jīng)探測(cè)器檢測(cè) ， 轉(zhuǎn)換為電
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