【正文】 v）聚山梨酯 80的 %無(wú)菌氯化鈉溶液 ， 將孢子洗脫 。 中國(guó)藥品生物制品檢定所 17 2022年版微生物限度檢查法修訂 附錄 108頁(yè)，增加： 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 細(xì)菌 、 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查 ，包括成品培養(yǎng)基 、 由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查 。 用適宜的無(wú)菌多孔材料 （ 如無(wú)菌紗布 ） 覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起 。 中國(guó)藥品生物制品檢定所 13 2022年版微生物限度檢查法修訂 附錄 107頁(yè)，檢驗(yàn)量 除另有規(guī)定外 ， 一般供試品的檢驗(yàn)量為 10g或 10ml；（ 中藥 ） 膜劑為 （ 50） 100cm2；貴重藥品 、 微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減 。中國(guó)藥典 2022年版微生物 限度檢查及發(fā)展趨勢(shì) 中國(guó)藥品生物制品檢定所 馬仕洪 2022年 web site: tel:01067095509 地址：北京市天壇西里 2號(hào) 郵編： 100050 中國(guó)藥品生物制品檢定所 2 無(wú)菌 /微生物限度檢查理念 環(huán)境保證 培養(yǎng)基保證 無(wú)菌性檢查 靈敏度檢查 有效的方法 方法驗(yàn)證 SOP操作 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 結(jié)果判斷 中國(guó)藥品生物制品檢定所 3 微生物限度檢查現(xiàn)狀 方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善 技術(shù)現(xiàn)狀與標(biāo)準(zhǔn)化 微生物限度檢查的幾個(gè)問(wèn)題 微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則（逐條解讀） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 4 方法和標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善 ? 表 8 中國(guó)藥典 2022版微生物限度檢查法與英美藥典比較 比較項(xiàng)目 ChP2022 USP29 BP2022 檢驗(yàn)條件規(guī)定 總體 10000級(jí)、局部 100級(jí) 無(wú)具體規(guī)定 無(wú)具體規(guī)定 計(jì)數(shù)測(cè)定方法 平皿法、薄膜過(guò)濾法、 MPN 平皿法、 MPN 平皿法、薄膜過(guò)濾法、 MPN 控制 大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌 (10)、銅綠假單胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌 大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金葡球菌、大腸菌群、腸道菌、腸桿菌科 大腸埃希菌、沙門菌 (10)、銅綠假單胞菌、金葡球菌；腸桿菌科及某些革蘭陰性菌 稀釋液 蛋白胨緩沖液；； %NaCl ；大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基 /乳糖肉湯培養(yǎng)基 蛋白胨緩沖液；乳糖肉湯 /其他培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件與時(shí)間 細(xì)菌數(shù)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂， 48hrs 霉菌及酵母：玫瑰紅鈉瓊脂，72hrs,5～ 7天 需氣菌總數(shù)：大豆酪蛋白消化物瓊脂， 48～ 72hrs 霉菌及酵母：沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂， 5～ 7天 需氣菌總數(shù)：大豆酪蛋白消化物瓊脂， 5天 霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂、大豆酪蛋白消化物瓊脂， 5天 控制菌檢查結(jié)果判斷與復(fù)試規(guī)定 一次檢出為準(zhǔn) 不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取大于 25g的樣品復(fù)試 一次檢出為準(zhǔn) 計(jì)數(shù)結(jié)果判斷與復(fù)試規(guī)定 第一次結(jié)果超過(guò)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)試兩次，三次結(jié)果平均報(bào)告 不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取大于 25g的樣品復(fù)試 測(cè)定結(jié)果在規(guī)定的限度標(biāo)準(zhǔn) 5倍以內(nèi)均為合格 中國(guó)藥品生物制品檢定所 5 樣品 10g或 10ml+緩沖液至 100ml 總需氧菌 TSA, 35℃ ,48 72h 真菌 SDA(PDA), 2025℃ ,5 7d 結(jié)果 (cfu/ml or g) 取 1ml樣品液 圖 14 USP、 BP總需氣菌 /霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)流程 總需氣菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù) 中國(guó)藥典 : 玫瑰紅鈉瓊脂 , 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂 中國(guó)藥品生物制品檢定所 6 ?對(duì)供試品的前處理和一些檢驗(yàn)方法進(jìn)行了完善； ?具有明顯的中國(guó)特色，與國(guó)際差距顯著。 檢驗(yàn)結(jié)果以 1g、 1ml、 10g、 10ml、 10cm2 為單位報(bào)告 ， 特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告 。 中國(guó)藥品生物制品檢定所 15 2022年版微生物限度檢查法修訂 附錄 108頁(yè)，新增：貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品 ， 去掉貼劑的保護(hù)層 ， 放置在無(wú)菌玻璃或塑料片上 ， 粘貼面朝上 。用于細(xì)菌檢查。 上述培養(yǎng)物用%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每 1ml含菌數(shù)為 50～ 100cfu的菌懸液 。 黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在 2～ 8℃ ， 在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)替代對(duì)應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用 。 判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定 。然而，供試品也可能僅對(duì)試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。 中國(guó)藥品生物制品檢定所 21 2022年版微生物限度檢查法修訂 附錄 109頁(yè)，修訂： 供試品檢查（法） ? （ 取按驗(yàn)證的方法制備的均勻供試液 ， ） 按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備 。 中國(guó)藥品生物制品檢定所 23 2022年版微生物限度檢查法修訂 1附錄 109頁(yè)，修訂：菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 ? 細(xì)菌 、 酵母菌宜選取 （ 細(xì)菌 、 酵母菌平均菌落數(shù)在 30～300之間 ） 小于 300cfu、 霉菌宜選取平均菌落數(shù) （ 在 30～100之間 ） 小于 100cfu的稀釋級(jí) ， 作為菌數(shù)報(bào)告 （ 取兩位有效數(shù)字 ） 的依據(jù) 。 中國(guó)藥品生物制品檢定所 25 2022年版微生物限度檢查法修訂 1附錄 110頁(yè)，增加：控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查 ? 控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查 ， 成品培養(yǎng)基 、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查 。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。 ? 培養(yǎng)基指示能力檢查 ：分別接種少量試驗(yàn)菌（見表 2）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時(shí)間下培養(yǎng)。 中國(guó)藥品生物制品檢定所 29 2022年版微生物限度檢查法修訂 1附錄 111頁(yè)，增加：白色念珠菌 取供試液 10ml（ 相當(dāng)于供試品 1g、 1ml、 10cm2） 直接或處理后接種至適量 （ 不少于 100ml） 的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中 ， 培養(yǎng) 24～ 48 小時(shí) 。 如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似 ， 應(yīng)挑選2～ 3個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上 ， 培養(yǎng) 24～ 48小時(shí) （ 必要時(shí)延長(zhǎng)至 72小時(shí) ） 。 芽管試驗(yàn) 挑取 1%吐溫 80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物 ， 接種于加有一滴血清的載玻片上 ， 蓋上蓋玻片 ， 置濕潤(rùn)的平皿內(nèi) ， 置 35～ 37℃ 、 1～ 3h， 置顯微鏡下觀察 ， 可見到由孢子長(zhǎng)出短小芽管 。 固體培養(yǎng)基的靈敏度。所以世界各國(guó)藥典均規(guī)定應(yīng)對(duì)原料藥進(jìn)行微生物檢查，以消除或控制其對(duì)藥品引入的微生物污染。考慮到生產(chǎn)過(guò)程中污染微生物可能發(fā)生的變化，國(guó)外企業(yè)通常在生產(chǎn)上自覺執(zhí)行比制劑要求更為嚴(yán)格的原料藥微生物。 ? （ 4）方法不合理 ? 對(duì)于原料藥微生物檢查方法驗(yàn)證應(yīng)與藥品制劑微生物檢查方法驗(yàn)證同等重視，否則同樣存在檢驗(yàn)方法不合理、不科學(xué)，檢驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有意義的問(wèn)題。但我國(guó)引入后，造成企業(yè)大量