大腸桿菌實驗診斷研究進展（ppt44）-經(jīng)營管理-預覽頁
【正文】 10mg/L 新生霉素的 EB肉湯或腸道增菌液 ? 含 10mg/L 新生霉素或 10mg/L鹽酸 吖啶黃的胰蛋白胨大豆肉湯 ? 新生霉素 MEC肉湯 ? 月桂基胰蛋白胨肉湯 ? 加入下例任何一種抑制劑均可增加培養(yǎng)基的選擇性 ? 頭孢克肟 ? 新生霉素 10mg/L 萬古霉素 40mg/L 2．免疫磁珠分離法 ? 免疫磁珠分離法是將特異性抗體吸附于一種能被吸附的磁性珠子上 ,然后利用抗原抗體反應(yīng)特性將樣品中的大腸桿菌 O157: H7富集起來 。架上 。 37℃培養(yǎng) 624小時，挑取可疑菌落進行鑒定。 ? Chapman等先用 EC肉湯增菌 ,然后用免疫磁珠分離法富集牛糞便大腸桿菌 O157: H7菌株 ,再用選擇性培養(yǎng)基分離 ， 并與 CRSMAC和 CTMAC直接培養(yǎng)作比較 。 因此 ,IMS提高了大腸桿菌O157: H7感染病例的檢出率 ,與 PCR符合率高 。結(jié)果顯示 ,在原緩沖液檢出大腸腸菌的范固為 100－ 1000 cfu/lm,在食品檢出的范圍為 1000－ 2020cfu/lm ， 檢測時間十分快 ,一般不到 1小時。用含吐溫－20 的 PBS洗滌磁珠可減少其它微生物與磁珠的非特異性結(jié)合。 因此用生化試驗確定為大腸桿菌是必須的 。Thompson等建立了一種快速 MUG試驗 ,取 MUG試劑 ,以無菌棉簽挑取待檢菌純培養(yǎng)物混勻于其中 ,℃ 置 20min,暗室內(nèi)高強度光源下觀察結(jié)果 ,產(chǎn)生藍色熒光者為陽性 。鑒定 H抗原也應(yīng)同時做玻片和試管凝集試驗 ,并應(yīng)先對待檢菌做動力試驗 ,在動力活潑時取培養(yǎng)物做 H抗原鑒定。 ? 膠體金的制備多采用還原法 ， 氯金酸是主要還原材料 。顯色程度與樣品中細菌含量成正比，最低測菌量為少于 100個菌細胞，主要特點是敏感性高，可用于待檢樣品初篩，陽性樣品可進行細菌分離，減少工作量。 常規(guī)培養(yǎng)法陰性 176份 ,而ELISA陰性 174份 。 單克隆抗體用于檢測大腸桿菌O157: H7有明顯特異性 ， 可作為一種免疫試劑用于臨床和食物標本的快速檢測 。 DEFT的基本原理為 :對樣品進行過濾 ,用熒光染料 (如吖啶橙 )對留在濾膜上的菌細胞染色后 ,用熒光顯微鏡觀察計數(shù)。 Czajlu等用熱殺死的 O157: H7菌包被玻璃毛細管作固形支持物。 6．間接血凝分析 (IEHA) ? 該法多用于對 LPS、 可溶性本體抗原 、 未加熱抗原的抗體檢測 ,對檢測 H抗原的抗體效果不佳 。 可直接從感染性疾病患者標本中檢測細菌 、 病毒 、弓形蟲 、 衣原體和螺旋體等微生物的抗原 、 抗體或毒素 。包括 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移電泳、免疫檢測三部分。 二．分子生物學檢測 分子生物學的出現(xiàn)，為更快診斷微生物提供了許多分子學工具。自動化 DNA提取儀，聚合酶鏈式反應(yīng)儀 (PCR儀 )， DNA序列分析儀，脈沖凝膠電泳儀 (用于分離 DNA大片段，如完整的染色體 ) 在疾病診斷中都是很有用的。 ? 雜交方法：斑點雜交 、 southern印跡 、 原位雜交 、 Northern印跡 等 。 Thomas等用地高辛標記的 VT2B亞單位基因 、 VT2C基因探針檢測不同噬菌體型 O157: H7菌 。 PCR技術(shù)擴增體系的基本成分 ? 引物 : PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。 TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導致非特異 DNA擴增 。 ? 緩沖液及其他成份： PCR反應(yīng)體系中，一般采用 TrisHCl緩沖液。 循環(huán)參數(shù) 1． 變性溫度和時間 模板 DNA和 PCR產(chǎn)物的變性不完全 ， 是 PCR反應(yīng)失敗最常見的一個原因 ,在變性步驟 ， 使溫度達到雙鏈 DNA完全分離的變性條件是 95 ℃ ，30s。 原則上變性步驟應(yīng)高溫 、 短時 ， 即要保證變性充分 ， 又要保持聚合酶在整個反應(yīng)中的活性 。 循環(huán)參數(shù) 3． 引物延伸 ： 引物延伸是 DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物的 3’ 一 OH末端 ， 引物延伸溫度取決于 DNA聚合酶的最適溫度 。 對于擴增 100— 300個堿基的短序列片段 ， 可省去延伸溫度這一步驟 ， 而采用快速簡便的變性 、 退火雙溫循環(huán) 。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測分析 PCR擴增產(chǎn)物的方法。 ? Thomas等用 PCR擴增了 slt基因片段 。 PCR技術(shù)在 大腸桿菌 O157: H7檢測中的應(yīng)用 ? （ 2） 多重 PCR:由于鑒定 O157: H7血清型不能僅僅依靠簡單 PCR,近年來國外學者對多重 PCR方法在大腸桿菌 O157: H7的診斷價值方面進行了研究 。 嚴笠選用針對大腸桿菌 O157: H7志賀樣毒素 Ⅰ 、 Ⅱ （ SLT－ Ⅰ 、SLT－ Ⅱ ） 和溶血素 （ Hly） 基因的三對引物 ,在同一擴增體系中進行 PCR,檢測 12株不同來源的 O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌 、 志賀菌 15株 。 大腸桿菌 O157: H7分型、檢測中的應(yīng)用 ? 傳統(tǒng)的細菌分類方法主要依賴于細菌的形態(tài)學、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。目前已知 23SrRNA基因全長序列的菌種數(shù)目已達 250種。同時對已知 23SrRNA基因序列分析也發(fā)現(xiàn)，在最初的 520pb中有 6個保守區(qū)域（ 510區(qū)域），并發(fā)現(xiàn)，這 6個保守區(qū)域中 6區(qū)段和 10區(qū)段最保守，該序列在 14個菌種中完全一致。為流行病提供依據(jù)。 另外 ,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在許多變異株 ,單用一種方法來檢測往往是不夠的 。
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