【正文】 ber 17, 2024 人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。 77: 1848 PCRRFLP Fang DC, et al. J Clin Pathol 1998。 86: 6230 DNA芯片技術(shù) Yershov G, et al. Pioc Natl Acad Sci USA,1996。 12: 301 突變體富集PCR Boumforth KRV, et al. Mol Pathol, 1999。 7: 423 Southern blot Northern blot 許良中，實(shí)用腫瘤病理方法學(xué)。,隨著人類基因組計(jì)劃和后基因組（蛋白質(zhì)組）計(jì)劃的實(shí)施，分子診斷也將得到進(jìn)一步完善和成熟，使人類最認(rèn)清腫瘤的本質(zhì)并攻克它。 該法省時(shí)簡便。 端粒酶的表達(dá)水平有可能為腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、預(yù)后等提供指標(biāo)，并有可能以抑制端粒酶表達(dá)為手段作為腫瘤治療的新方法。端粒酶為由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），含有端粒重復(fù)序列的模板，即以自身RNA組分為模板，復(fù)制合成端粒序列。人的端粒長度大約15kb，隨著細(xì)胞的每次分裂，端粒逐漸縮短，每次丟失50200個(gè)核苷酸。,二、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測 基本方法為首先用PCR技術(shù)擴(kuò)增所需的雙核苷酸重復(fù)序列，然后用凝膠電泳分析DNA序列。在n≥14時(shí)，2bp重復(fù)序列在人群中就呈高度多態(tài)性。,第四節(jié) 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析,一、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與腫瘤 小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA），又稱VNTR。,二、RFLP的檢測 采集配對樣本，既腫瘤組織和同一患者的正常體細(xì)胞（可用周圍血細(xì)胞或腫瘤旁組織），分別提取基因組DNA，特定的內(nèi)切酶酶切、電泳、轉(zhuǎn)印，與標(biāo)記探針進(jìn)行Southern雜交后，分析等位基因的變化。,人類基因組中含有一些復(fù)雜序列家族，有些重復(fù)序列分散在基因組中，有些是以一系列短的重復(fù)序列排列組成高變區(qū)，其串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)可相差很多，出現(xiàn)可變數(shù)的串聯(lián)重復(fù)，約占單倍體DNA的10%，基本上位于非編碼區(qū)，重復(fù)單位以670bp為多，重復(fù)次數(shù)約6100次，稱為數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeat, VNTR）。 直接測序法（direct sequencing，DS） PCR循環(huán)測序法,雙脫氧終止法 基本原理,第三節(jié) 限制性酶切片段長度多態(tài)性分析,一、等位基因不平衡 應(yīng)用同一腫瘤的正常體細(xì)胞（常分為血細(xì)胞或腫瘤旁正常組織）和腫瘤細(xì)胞的DNA，檢測DNA多態(tài)性座位上等位基因不平衡性。 該法可用于12kb的大片段進(jìn)行檢測，并能確定突變位點(diǎn)。 可以選用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時(shí)以野生型探針為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，則表示樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點(diǎn)突變。,該法檢出率很高，也是檢測片段最長的方法。,（三）突變體富集PCR （mutantenriched PCR） 利用癌基因或抑癌基因某個(gè)編碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用連續(xù)二次的巢式PCR來擴(kuò)增包括存在酶位點(diǎn)編碼子的DNA片段，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。 應(yīng)用PCRSSCP檢測點(diǎn)突變已見報(bào)道于人類大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法。,該法不能測定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過序列分析來確定。 細(xì)胞癌基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，由內(nèi)含子分隔，其中有些序列起到促進(jìn)子和調(diào)節(jié)基因的作用，如染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時(shí)，可使細(xì)胞癌基因于正常的抑制子分開而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子為Burkitt淋巴瘤。,基因缺失中較為頻發(fā)的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因雜合型和純合型丟失。,一、基因突變的形式 點(diǎn)突變（point mutation） 基因缺失(gene losses) 基因異位或重排 （gene translocation and rearrangment）,（一）點(diǎn)突變（point mutation） 指基因在特異位置發(fā)生一個(gè)核苷酸的改變，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和生物學(xué)功能。 操作過程要嚴(yán)格控制RNase的污染。,Southern雜交： 一種DNA特定序列定位技術(shù)。,分類： DNADNA雜交 DNARNA雜交 RNARNA雜交 直接法 間接法 同位素標(biāo)記 非同位素標(biāo)記 生物素、地高素、熒光素等 雙重標(biāo)記原位雜交技術(shù),熒光原位雜交（FISH） 將熒光素標(biāo)記克隆的DNA片段與染色體或細(xì)胞間期染色質(zhì)雜交，以測試該特定的DNA片段是否有缺失或擴(kuò)增。,第一節(jié) 腫瘤基因過表達(dá)及其檢測,一、基因過表達(dá)的形式 癌基因一般為單拷貝基因，有其編碼的蛋白質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些癌基因在DNA復(fù)制過程中形成多個(gè)拷貝，形成雙微粒染色體和均染區(qū)，各種基因的擴(kuò)增常產(chǎn)生基因產(chǎn)物過表達(dá)，表現(xiàn)為RNA和蛋白質(zhì)量的增加。研究較為深入當(dāng)屬癌基因、抑癌基因及其它相關(guān)基因。組織細(xì)胞分布和雜交電鏡的亞細(xì)胞 定位研究。 一種敏感性高、特異性強(qiáng)，能在組織細(xì)胞原位進(jìn)行低拷貝數(shù)基因定性的研究方法。,注意問題： 提取組織或細(xì)胞中的RNA，不需酶切而直接采用電泳。 基因突變是一復(fù)雜的過程，不僅在腫瘤細(xì)胞中檢測到突變基因，對于某些癌前病變或癌前狀態(tài)的組織細(xì)胞中也存在不同形式和不同程度的基因突變，在同一