【正文】 統(tǒng)發(fā)育分析的免費(fèi)軟件包，其操作界面清晰簡(jiǎn)單，主要功能包括核酸和蛋白質(zhì)序列的多序列比對(duì)、對(duì)比對(duì)序列的統(tǒng)計(jì)分析，估算進(jìn)化距離 (geic distance)和標(biāo)準(zhǔn)誤、和系統(tǒng)樹(shù)的推斷和檢驗(yàn) 10 等 [32]。 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)、純化及測(cè)序 PCR 產(chǎn)物檢測(cè) ,取 5ul 的反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng) %瓊脂糖凝膠電泳后 （ 57V， 小時(shí)） EB 染色 小時(shí) ，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)是否有目標(biāo)條帶并照相；產(chǎn)物的純化和測(cè)序均有上海博尚生物技術(shù)公司完成。 12 用 40ul TE Buffer 重溶所得基因組 DNA， 然后 ， 置 － 20℃保存?zhèn)溆谩? 8 在上層清液中加入 2 倍體積無(wú)水乙醇（－ 20℃）沉降 DNA 過(guò)夜。巰基乙醇溶液，輕輕搖勻。提取具體步驟如下： 1 將 2%CTAB Buffer 預(yù)熱至 60℃ 。 主要溶液 DNA 提取常規(guī)溶液配制： TE 溶液（ ）： 10mmol/L TrisHCl， （ ， 1 mmol/L EDTA（ ） 2CTAB 100ml 提取液： CTAB 2g， Nacl ， TrisHcl（ ） ， EDTA（ ） ， PVP（ 1%） 1g。 以蕨葉蜂亞科 Selandriinae、平背葉蜂亞科Allantinae、巨基葉蜂亞科 Megabelesesinae 及藺葉蜂亞科 Belesesinae 為內(nèi)群，從Genbank 下載 Runaria reducta 的 28S DNA 及 Cytb 基因序列做 為外群。 2 材料與方法 標(biāo)本及來(lái)源 本研究提取了葉蜂科昆蟲(chóng) 10 個(gè)樣品的基因組 DNA，標(biāo)本是中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲(chóng)系統(tǒng)與進(jìn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室人員在野外采集的近三年標(biāo)本， 100% 酒精浸泡，﹣ 20℃保存。蕭剛?cè)嵯壬?1991 年總結(jié)了中國(guó)葉蜂的系統(tǒng)分類研究成果 [28]。 2020 年 Schulmeister[1]提 5 出了葉蜂總科的系統(tǒng)關(guān)系 : （葉蜂科（不包括殘青葉蜂科） + 錘角葉蜂科 + 松葉蜂科）是單系群，并且作為（三節(jié)葉蜂科 + 筒腹葉蜂科）的姐妹群，顯然是葉蜂科的并系， 而去除殘青葉蜂科外的其余葉蜂科類群是單系 [17]。在進(jìn)化速率可變的前提下，最大簡(jiǎn)約法略差于轉(zhuǎn)換距離法和鄰接法，最大似然法結(jié)果最優(yōu)。這些方法依賴校正距離系數(shù)的準(zhǔn)確性。 貝葉斯法 [16]（ Bayesain analysis）建立在 ML基礎(chǔ)上的但比 ML更為捷徑的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，它采用了 ML法的基本原理，同時(shí)引進(jìn)了馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法 (the Markov Chain Monthe Carloanlysis， MCMC)途徑，將運(yùn)算效率提高，大大地縮短運(yùn)算時(shí)間，最終獲得一組似然率最大樹(shù)構(gòu)成的合意樹(shù)，直接估算貝葉斯后驗(yàn)概率 (Bayesain Posterior Probabilities)。對(duì) DNA 序列而言，理論上每個(gè)位點(diǎn)均可以構(gòu)建三種可能的譜系樹(shù)，然而并非所有的位點(diǎn)都可用于重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。②鄰接法（ neighber－ jointing method）原理是逐漸尋找新的近鄰，使最終生成的分支樹(shù)的總長(zhǎng)度達(dá)到最小。 分子系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建方法 分子系統(tǒng)學(xué)的主要目的是根據(jù)分子數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，已有很多統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以用于分析分子數(shù)據(jù)來(lái)重建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通常使用的方法分為 4 類：距離法、簡(jiǎn)約法、似然法以及貝葉斯法。有學(xué)者認(rèn)為，由于核基因沒(méi)有線粒體基因的替代偏異特征，昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)應(yīng)該更加關(guān)注核基因數(shù)據(jù)而不是線粒體基因數(shù)據(jù)。胡婧 [12]年以網(wǎng)翅蝗科的 6 種昆蟲(chóng)作為材料，通過(guò)特異性引物，對(duì) mt 16S rRNA 基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增。 mtDNA 基因組中不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，無(wú)重復(fù)序列和不等交換，在遺傳過(guò)程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變，并且遵守嚴(yán)格的母系遺傳方式，可以簡(jiǎn)單地認(rèn)為 mtDNA 是克隆型。對(duì)細(xì)胞色素 b 在電子傳遞鏈中的復(fù)雜功能至今還不清楚。核基因中含有更加豐富的生物學(xué)信息，用適當(dāng)?shù)暮嘶蜓芯坷ハx(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育，其結(jié)果更有可能比較真實(shí)地反映出昆蟲(chóng)的進(jìn)化歷史。而 mtDNA 在進(jìn)化研究中非常有用，一直應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)和基因流、雜交、生物地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育的研究 [5 ]。 Col 是細(xì)胞色素 C氧化酶中最大和最保守的 亞基，葉蜂中 COl 全長(zhǎng) 860bp。 COI 基因是 mtDNA13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之一。但隨著學(xué)科的發(fā)展也遇到了一些傳統(tǒng)方法難以解決的困難，例如，一些近緣種很難確定其分類地位，對(duì)于種群、生態(tài)型的研究更是如此。葉蜂科是葉蜂總科最大的科，大概有 7000 余種，已知 5000 種以上，中國(guó)種類超過(guò) 300屬 2000 種 ,這個(gè)類群對(duì)農(nóng)、林害蟲(chóng)種群控制和保持生態(tài)平衡起到一種關(guān)鍵性的自然調(diào)控作用。 葉蜂總科 (Tenthredinoidea)隸屬于昆蟲(chóng)綱膜翅目 (Hymenoptera)廣腰亞目 (Symphyta)，種類極多，分布廣泛。 傳統(tǒng)的昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究主要依賴形態(tài)解剖特征、生物學(xué)性狀以及生物地理學(xué)信息等，這些依據(jù)在大多數(shù)情況下能清晰的反映一個(gè)物種的分類地位或系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。 20年來(lái)，昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)快速發(fā)展， 目前應(yīng)用核酸序列分析技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)特定的核苷酸序列，以比較不同昆蟲(chóng)之間的演化關(guān)系，建立符合自然發(fā)育的分子系統(tǒng)譜系，是昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)發(fā)育方面的主要研究方向之一。這些亞基多為跨膜蛋白，跨過(guò)線粒體的內(nèi)膜，亞基 I 和 11 組成酶的催化核心。其中細(xì)胞核 DNA 或 mtDNA 的序列分析是一項(xiàng)最急需的技術(shù)，它提供了大量的詳細(xì)資料。 核基因序列 生物 的性狀基本由核基因決定。對(duì)細(xì)胞色素 b 氨基酸組成和結(jié)構(gòu)基因的 脫氧核糖核酸 (DNA)順序研究指出 ,約 68％的氨基酸為非極性的。對(duì)進(jìn)化過(guò)程中不同生物體的 DNA 序列的核苷酸替換率的比較研究發(fā)現(xiàn)， mtDNA 基因組的替換率比核 DNA 高 5～ 10 倍。印紅 [11]將我國(guó)直翅目蝗總科 8 科 8 個(gè)種和從互聯(lián)網(wǎng) GenBank 中檢索到相關(guān)物種的線粒體基因組 16S rRNA 序列片段 進(jìn)行同源性比較，計(jì)算核苷酸使用頻率，并構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。 現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，快 速進(jìn)化的基因或者核苷酸區(qū)段（如線粒體 DNA、線粒體的 rRNA 的 IGS 區(qū)域）適合于種內(nèi)或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析；慢速進(jìn)化的基因（如核糖體 DNA 及其產(chǎn)物 rRNA）適合于遠(yuǎn)緣種類或高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育。但是目前在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、資料積累、數(shù)據(jù)處理分析以及序列數(shù)據(jù)的可比性等方面還有待于進(jìn)一步的完善和充實(shí)。一對(duì)序列間的距離是分支長(zhǎng)度的總和。所產(chǎn)生的最大簡(jiǎn)約樹(shù)中，所有類群的性狀狀態(tài)的變化總數(shù)也最小。以核酸替代模型為基礎(chǔ)， ML法需要確定每個(gè)分支在一定時(shí)間間隔內(nèi)核苷酸發(fā)生特定替代變化的概率。鄰接法和轉(zhuǎn)換距離法不包括速率一致的假設(shè)，但均采用校正距離矩陣來(lái)減少各分支不同速率的影響。計(jì)算機(jī)模擬研究表明：在進(jìn)化速率恒定的前提下，最大似然法的結(jié)果質(zhì)量則依賴序列進(jìn)化模式的確定。研究葉蜂總科內(nèi)部的系統(tǒng)關(guān)系對(duì)解決整個(gè)廣腰亞目之間的關(guān)系有至關(guān)重要的作用。 中國(guó)葉蜂研究的工作在新中國(guó)成立以后繁榮起來(lái)，葉蜂研究的工作者越來(lái)越多，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所的朱弘復(fù)、王林瑤、袁德成，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院的黃孝運(yùn)、周淑芷、肖剛?cè)?、吳?jiān)、張真等先后報(bào)道了中國(guó)一些葉蜂的新種 [1827]。 葉蜂總科是廣腰亞目最大的總科，中國(guó)己記載 6 個(gè)科，分別為三節(jié)葉蜂科Argidae，葉蜂科 Tenthredinidae，松葉蜂科 Diprionidae，錘角葉蜂科 Cimbicidae，筒腹葉蜂科 Pergidae 和茸蜂科 Blasticotomidae。提取的 DNA 和殘骸標(biāo)本均保存于中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲(chóng)系統(tǒng)與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室。 主要試劑 溴代十六烷基三甲胺（ CTAB）； Tris 飽和酚 ；乙二胺四乙酸（ EDTA）；溴化乙錠（ EB）； Taq DNA 聚合酶（ TakaRa）；瓊脂糖； 250bpDNA Marker；其余試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 實(shí)驗(yàn)方法 基因組 DNA 的提取 本文采用 CTAB 法和試劑盒法提取葉峰基因組 DNA。 4 在所得溶液加入 2ul 25mg/mlProk(終濃度 100mg/ml)和 223。 7 在上清液中加入 4℃ 等體積氯仿 /異戊醇 （ 24:1）混合液混勻，然后在7000rpm 下離心 10min，取上層清液，量體積；重復(fù)一次。 11 自然干燥。 后期更換為 PCR 反應(yīng)體系 2，亦為 50ul 體系，成分如下： 濃度 體積 Taq MasterMix 25ul Primer1 10ul/mol 2ul Primer2 10ul/mol 2ul Template 2ul RNaseFree water 19ul PCR 反應(yīng)體系 2 的反應(yīng)參數(shù)為： 由于實(shí)驗(yàn)樣品有限，在實(shí)驗(yàn)后期更改為 25ul 體系，即以上兩個(gè)反應(yīng)體系的每種成分均減 半。這個(gè)程序基于漸進(jìn)比對(duì)的思想，得到一系列序列的輸入，對(duì)每?jī)蓚€(gè)序列進(jìn)行成對(duì)比對(duì) (pairwise alignment)并且計(jì)算結(jié)果。 外群的選擇 選取 Runaria reducta 這個(gè)種為外群。本 文選用 NJ、 ME 和 MP 分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。 圖 2 所測(cè)樣品 PCR檢測(cè)結(jié)果 2 M 1 2 3 4 5 注： M： Marker： 200bp； 1： Pachyprotasis wui； 2： Pachyprotasis sellata； 3： Cibdela chinensis； 4： Megabeleses liriodendrovorax； 5： Aneugmenus pteridii。 堿基替換統(tǒng)計(jì)與遺傳距離 堿基替換統(tǒng)計(jì) 對(duì) 28S DNA 基因序列進(jìn)行堿基替換統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表 3 表 3 28S rDNA基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)表 Domain ii si sv R TotalDomainInfo Avg 1022 21 12 1st 342 7 3 1st Pos Data 2nd 338 10 7 2nd Pos Data 3rd 342 5 4 3rd Pos Data 對(duì) 28S rDNA 基因序列進(jìn)行堿基替換統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表 4 13 表 4 Cytb DNA基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)表 Domain ii si sv R TotalDomainInfo Avg 412 106 137 1st 141 33 41 1st Pos Data 2nd 131 42 46 2nd Pos Data 3rd 139 31 50 3rd Pos Data ii 表示不變位點(diǎn) ii = Identical Pairs si 表示轉(zhuǎn)換位點(diǎn) si = Transitionsal Pairs sv 表示顛換位點(diǎn) sv = Transversional Pairs R 表示轉(zhuǎn)換與顛換的比值 R = si/sv Domain 表示統(tǒng)計(jì)內(nèi)容 Total 表示總長(zhǎng) Domain Info 表示統(tǒng)計(jì)所包括的位點(diǎn) 利用表 3中統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算出 28S DNA 轉(zhuǎn)換取代 (transition)的速率為 %，顛換取代 (transversion)的速率為 %，顛換取代的速率略低于轉(zhuǎn)換取代的速率，轉(zhuǎn)換速率與顛換速率之比 R=。 5 8 Ta x o n u s a t t e n a t u s 2 8 S 6 3 L i n o m o r p h a f l a v a 2 8 S 1 5 3 A l l a n t u s n i g r o c a e r u l e u s 9 1 M e g a b e l e s e s l i r i o d e n d r o v o r a x 1 7 8 A b e l e s e s r u f o t i b i a l i s 2 1 9 B e l e s e s n i g r o a p i c a l i s 1 7 5 N e o s t r o m b o c e r o s n i p p o n i c u s 5 5 E u f o r s i u s p i e l i 2 8 S 8 7 A n e u g m e n u s f r o n t a l i s 2 8 S 1 7 3 A n e u g m e n u s p t e r i d i i R u n a r i a r e d u c t a d o w n l o a d ) 圖 2： 28S rDNA 基因部分序列經(jīng) PAUP 分析產(chǎn)生 MP 樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。目前 DNA 序列數(shù)據(jù)已廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)研究中，并取得了一定的結(jié)果。 在進(jìn)一步的研究中，應(yīng)增加樣本的種類和數(shù)量，使分類單元更具代表性， 本文研究的葉蜂總科昆蟲(chóng)只有 5 屬，以后可以增加更多的研究類群。老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、忘我的工作精神、敏銳的學(xué)術(shù)洞察力、謙遜平和的性格、誨人不倦的育人風(fēng)格是我做人和學(xué)習(xí)的楷模，也是我今后努力和學(xué)習(xí)的方向。 17 參考文獻(xiàn) [1] Schulmeister, analysis of basal Hymenop