【正文】 統(tǒng)發(fā)育分析的免費軟件包，其操作界面清晰簡單，主要功能包括核酸和蛋白質(zhì)序列的多序列比對、對比對序列的統(tǒng)計分析，估算進化距離 (geic distance)和標準誤、和系統(tǒng)樹的推斷和檢驗 10 等 [32]。 PCR 產(chǎn)物檢測、純化及測序 PCR 產(chǎn)物檢測 ,取 5ul 的反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng) %瓊脂糖凝膠電泳后 （ 57V， 小時） EB 染色 小時 ，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測是否有目標條帶并照相；產(chǎn)物的純化和測序均有上海博尚生物技術(shù)公司完成。 12 用 40ul TE Buffer 重溶所得基因組 DNA， 然后 ， 置 － 20℃保存?zhèn)溆谩? 8 在上層清液中加入 2 倍體積無水乙醇（－ 20℃）沉降 DNA 過夜。巰基乙醇溶液，輕輕搖勻。提取具體步驟如下： 1 將 2%CTAB Buffer 預熱至 60℃ 。 主要溶液 DNA 提取常規(guī)溶液配制： TE 溶液（ ）： 10mmol/L TrisHCl， （ ， 1 mmol/L EDTA（ ） 2CTAB 100ml 提取液： CTAB 2g， Nacl ， TrisHcl（ ） ， EDTA（ ） ， PVP（ 1%） 1g。 以蕨葉蜂亞科 Selandriinae、平背葉蜂亞科Allantinae、巨基葉蜂亞科 Megabelesesinae 及藺葉蜂亞科 Belesesinae 為內(nèi)群，從Genbank 下載 Runaria reducta 的 28S DNA 及 Cytb 基因序列做 為外群。 2 材料與方法 標本及來源 本研究提取了葉蜂科昆蟲 10 個樣品的基因組 DNA，標本是中南林業(yè)科技大學昆蟲系統(tǒng)與進化生物學實驗室人員在野外采集的近三年標本， 100% 酒精浸泡，﹣ 20℃保存。蕭剛?cè)嵯壬?1991 年總結(jié)了中國葉蜂的系統(tǒng)分類研究成果 [28]。 2020 年 Schulmeister[1]提 5 出了葉蜂總科的系統(tǒng)關(guān)系 : （葉蜂科（不包括殘青葉蜂科） + 錘角葉蜂科 + 松葉蜂科）是單系群，并且作為（三節(jié)葉蜂科 + 筒腹葉蜂科）的姐妹群，顯然是葉蜂科的并系， 而去除殘青葉蜂科外的其余葉蜂科類群是單系 [17]。在進化速率可變的前提下，最大簡約法略差于轉(zhuǎn)換距離法和鄰接法，最大似然法結(jié)果最優(yōu)。這些方法依賴校正距離系數(shù)的準確性。 貝葉斯法 [16]（ Bayesain analysis）建立在 ML基礎(chǔ)上的但比 ML更為捷徑的一種統(tǒng)計學方法，它采用了 ML法的基本原理，同時引進了馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法 (the Markov Chain Monthe Carloanlysis， MCMC)途徑，將運算效率提高，大大地縮短運算時間，最終獲得一組似然率最大樹構(gòu)成的合意樹，直接估算貝葉斯后驗概率 (Bayesain Posterior Probabilities)。對 DNA 序列而言，理論上每個位點均可以構(gòu)建三種可能的譜系樹，然而并非所有的位點都可用于重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。②鄰接法（ neighber－ jointing method）原理是逐漸尋找新的近鄰，使最終生成的分支樹的總長度達到最小。 分子系統(tǒng)樹構(gòu)建方法 分子系統(tǒng)學的主要目的是根據(jù)分子數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)樹，已有很多統(tǒng)計學方法可以用于分析分子數(shù)據(jù)來重建系統(tǒng)發(fā)育樹，通常使用的方法分為 4 類：距離法、簡約法、似然法以及貝葉斯法。有學者認為，由于核基因沒有線粒體基因的替代偏異特征，昆蟲分子系統(tǒng)學應(yīng)該更加關(guān)注核基因數(shù)據(jù)而不是線粒體基因數(shù)據(jù)。胡婧 [12]年以網(wǎng)翅蝗科的 6 種昆蟲作為材料，通過特異性引物，對 mt 16S rRNA 基因序列進行了擴增。 mtDNA 基因組中不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，無重復序列和不等交換，在遺傳過程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變，并且遵守嚴格的母系遺傳方式，可以簡單地認為 mtDNA 是克隆型。對細胞色素 b 在電子傳遞鏈中的復雜功能至今還不清楚。核基因中含有更加豐富的生物學信息，用適當?shù)暮嘶蜓芯坷ハx的系統(tǒng)發(fā)育，其結(jié)果更有可能比較真實地反映出昆蟲的進化歷史。而 mtDNA 在進化研究中非常有用，一直應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)和基因流、雜交、生物地理學和系統(tǒng)發(fā)育的研究 [5 ]。 Col 是細胞色素 C氧化酶中最大和最保守的 亞基，葉蜂中 COl 全長 860bp。 COI 基因是 mtDNA13 個蛋白質(zhì)編碼基因之一。但隨著學科的發(fā)展也遇到了一些傳統(tǒng)方法難以解決的困難，例如，一些近緣種很難確定其分類地位，對于種群、生態(tài)型的研究更是如此。葉蜂科是葉蜂總科最大的科，大概有 7000 余種，已知 5000 種以上，中國種類超過 300屬 2000 種 ,這個類群對農(nóng)、林害蟲種群控制和保持生態(tài)平衡起到一種關(guān)鍵性的自然調(diào)控作用。 葉蜂總科 (Tenthredinoidea)隸屬于昆蟲綱膜翅目 (Hymenoptera)廣腰亞目 (Symphyta)，種類極多，分布廣泛。 傳統(tǒng)的昆蟲系統(tǒng)學和系統(tǒng)發(fā)育研究主要依賴形態(tài)解剖特征、生物學性狀以及生物地理學信息等，這些依據(jù)在大多數(shù)情況下能清晰的反映一個物種的分類地位或系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。 20年來，昆蟲分子系統(tǒng)學快速發(fā)展， 目前應(yīng)用核酸序列分析技術(shù)測定昆蟲特定的核苷酸序列，以比較不同昆蟲之間的演化關(guān)系，建立符合自然發(fā)育的分子系統(tǒng)譜系，是昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育方面的主要研究方向之一。這些亞基多為跨膜蛋白，跨過線粒體的內(nèi)膜，亞基 I 和 11 組成酶的催化核心。其中細胞核 DNA 或 mtDNA 的序列分析是一項最急需的技術(shù)，它提供了大量的詳細資料。 核基因序列 生物 的性狀基本由核基因決定。對細胞色素 b 氨基酸組成和結(jié)構(gòu)基因的 脫氧核糖核酸 (DNA)順序研究指出 ,約 68％的氨基酸為非極性的。對進化過程中不同生物體的 DNA 序列的核苷酸替換率的比較研究發(fā)現(xiàn)， mtDNA 基因組的替換率比核 DNA 高 5～ 10 倍。印紅 [11]將我國直翅目蝗總科 8 科 8 個種和從互聯(lián)網(wǎng) GenBank 中檢索到相關(guān)物種的線粒體基因組 16S rRNA 序列片段 進行同源性比較，計算核苷酸使用頻率，并構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。 現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，快 速進化的基因或者核苷酸區(qū)段（如線粒體 DNA、線粒體的 rRNA 的 IGS 區(qū)域）適合于種內(nèi)或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析；慢速進化的基因（如核糖體 DNA 及其產(chǎn)物 rRNA）適合于遠緣種類或高級階元的系統(tǒng)發(fā)育。但是目前在實驗技術(shù)、資料積累、數(shù)據(jù)處理分析以及序列數(shù)據(jù)的可比性等方面還有待于進一步的完善和充實。一對序列間的距離是分支長度的總和。所產(chǎn)生的最大簡約樹中，所有類群的性狀狀態(tài)的變化總數(shù)也最小。以核酸替代模型為基礎(chǔ)， ML法需要確定每個分支在一定時間間隔內(nèi)核苷酸發(fā)生特定替代變化的概率。鄰接法和轉(zhuǎn)換距離法不包括速率一致的假設(shè)，但均采用校正距離矩陣來減少各分支不同速率的影響。計算機模擬研究表明：在進化速率恒定的前提下，最大似然法的結(jié)果質(zhì)量則依賴序列進化模式的確定。研究葉蜂總科內(nèi)部的系統(tǒng)關(guān)系對解決整個廣腰亞目之間的關(guān)系有至關(guān)重要的作用。 中國葉蜂研究的工作在新中國成立以后繁榮起來，葉蜂研究的工作者越來越多，中國科學院動物研究所的朱弘復、王林瑤、袁德成，中國林業(yè)科學研究院的黃孝運、周淑芷、肖剛?cè)?、吳堅、張真等先后報道了中國一些葉蜂的新種 [1827]。 葉蜂總科是廣腰亞目最大的總科，中國己記載 6 個科，分別為三節(jié)葉蜂科Argidae，葉蜂科 Tenthredinidae，松葉蜂科 Diprionidae，錘角葉蜂科 Cimbicidae，筒腹葉蜂科 Pergidae 和茸蜂科 Blasticotomidae。提取的 DNA 和殘骸標本均保存于中南林業(yè)科技大學昆蟲系統(tǒng)與進化實驗室。 主要試劑 溴代十六烷基三甲胺（ CTAB）； Tris 飽和酚 ；乙二胺四乙酸（ EDTA）；溴化乙錠（ EB）； Taq DNA 聚合酶（ TakaRa）；瓊脂糖； 250bpDNA Marker；其余試劑均為分析純； 實驗所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 實驗方法 基因組 DNA 的提取 本文采用 CTAB 法和試劑盒法提取葉峰基因組 DNA。 4 在所得溶液加入 2ul 25mg/mlProk(終濃度 100mg/ml)和 223。 7 在上清液中加入 4℃ 等體積氯仿 /異戊醇 （ 24:1）混合液混勻，然后在7000rpm 下離心 10min，取上層清液，量體積；重復一次。 11 自然干燥。 后期更換為 PCR 反應(yīng)體系 2，亦為 50ul 體系，成分如下： 濃度 體積 Taq MasterMix 25ul Primer1 10ul/mol 2ul Primer2 10ul/mol 2ul Template 2ul RNaseFree water 19ul PCR 反應(yīng)體系 2 的反應(yīng)參數(shù)為： 由于實驗樣品有限，在實驗后期更改為 25ul 體系，即以上兩個反應(yīng)體系的每種成分均減 半。這個程序基于漸進比對的思想，得到一系列序列的輸入，對每兩個序列進行成對比對 (pairwise alignment)并且計算結(jié)果。 外群的選擇 選取 Runaria reducta 這個種為外群。本 文選用 NJ、 ME 和 MP 分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 圖 2 所測樣品 PCR檢測結(jié)果 2 M 1 2 3 4 5 注： M： Marker： 200bp； 1： Pachyprotasis wui； 2： Pachyprotasis sellata； 3： Cibdela chinensis； 4： Megabeleses liriodendrovorax； 5： Aneugmenus pteridii。 堿基替換統(tǒng)計與遺傳距離 堿基替換統(tǒng)計 對 28S DNA 基因序列進行堿基替換統(tǒng)計結(jié)果見表 3 表 3 28S rDNA基因序列堿基替換統(tǒng)計表 Domain ii si sv R TotalDomainInfo Avg 1022 21 12 1st 342 7 3 1st Pos Data 2nd 338 10 7 2nd Pos Data 3rd 342 5 4 3rd Pos Data 對 28S rDNA 基因序列進行堿基替換統(tǒng)計結(jié)果見表 4 13 表 4 Cytb DNA基因序列堿基替換統(tǒng)計表 Domain ii si sv R TotalDomainInfo Avg 412 106 137 1st 141 33 41 1st Pos Data 2nd 131 42 46 2nd Pos Data 3rd 139 31 50 3rd Pos Data ii 表示不變位點 ii = Identical Pairs si 表示轉(zhuǎn)換位點 si = Transitionsal Pairs sv 表示顛換位點 sv = Transversional Pairs R 表示轉(zhuǎn)換與顛換的比值 R = si/sv Domain 表示統(tǒng)計內(nèi)容 Total 表示總長 Domain Info 表示統(tǒng)計所包括的位點 利用表 3中統(tǒng)計結(jié)果計算出 28S DNA 轉(zhuǎn)換取代 (transition)的速率為 %，顛換取代 (transversion)的速率為 %，顛換取代的速率略低于轉(zhuǎn)換取代的速率，轉(zhuǎn)換速率與顛換速率之比 R=。 5 8 Ta x o n u s a t t e n a t u s 2 8 S 6 3 L i n o m o r p h a f l a v a 2 8 S 1 5 3 A l l a n t u s n i g r o c a e r u l e u s 9 1 M e g a b e l e s e s l i r i o d e n d r o v o r a x 1 7 8 A b e l e s e s r u f o t i b i a l i s 2 1 9 B e l e s e s n i g r o a p i c a l i s 1 7 5 N e o s t r o m b o c e r o s n i p p o n i c u s 5 5 E u f o r s i u s p i e l i 2 8 S 8 7 A n e u g m e n u s f r o n t a l i s 2 8 S 1 7 3 A n e u g m e n u s p t e r i d i i R u n a r i a r e d u c t a d o w n l o a d ) 圖 2： 28S rDNA 基因部分序列經(jīng) PAUP 分析產(chǎn)生 MP 樹拓撲結(jié)構(gòu)圖。目前 DNA 序列數(shù)據(jù)已廣泛應(yīng)用于昆蟲系統(tǒng)學研究中，并取得了一定的結(jié)果。 在進一步的研究中，應(yīng)增加樣本的種類和數(shù)量，使分類單元更具代表性， 本文研究的葉蜂總科昆蟲只有 5 屬，以后可以增加更多的研究類群。老師嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、忘我的工作精神、敏銳的學術(shù)洞察力、謙遜平和的性格、誨人不倦的育人風格是我做人和學習的楷模，也是我今后努力和學習的方向。 17 參考文獻 [1] Schulmeister, analysis of basal Hymenop