第12章基因功能分析的基本策略-全文預(yù)覽
【正文】 1知人者智，自知者明。 上午 1時(shí) 40分 49秒 上午 1時(shí) 40分 01:40: 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 :40:4901:40:49March 29, 2023 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 , March 29, 2023 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒(méi)有。 2023年 3月 29日星期三 上午 1時(shí) 40分 49秒 01:40: 1比不了得就不比，得不到的就不要。 01:40:4901:40:4901:403/29/2023 1:40:49 AM 1以我獨(dú)沈久，愧君相見(jiàn)頻。 一般作為干涉的靶點(diǎn)序列應(yīng)具備 ：①、目標(biāo) RNA上被干涉的靶點(diǎn)應(yīng)盡量避開(kāi)蛋白結(jié)合位點(diǎn)②、被干涉的靶序列一般應(yīng)具有 AA（ N19） TT或 AA（ N21） 序列特征，同時(shí) G： C比為 50%左右③被干涉的靶序列應(yīng)該是特異性的，和其它 RNA沒(méi)有同源性。 RNAi整個(gè)過(guò)程一般分為 3個(gè)階段 ： dsRNA分子跨過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 RNA干涉的機(jī)制： 1. Dicer是由 核酸內(nèi)切酶 和 解旋酶 等組成的 酶復(fù)合體 。 反義 RNA是 作用于基因的啟動(dòng)子 ，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。目前在 RNA水平上分析基因功能的方法主要有兩類： 一類是反義 RNA技術(shù)封閉mRNA的功能；另一類是 RNA干涉技術(shù)使基因處于沉默狀態(tài)。這段34bp序列是重組酶識(shí)別的位點(diǎn)，被稱為 loxP位點(diǎn) (10cus of X— over in P1)。 ?這兩個(gè)系統(tǒng)的應(yīng)用，可以使靶基因的表達(dá)或缺失發(fā)生在試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官。 將發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入小鼠胚泡中，然后將胚泡植入假孕小鼠子宮中； 篩選嵌合體小鼠。 這樣 打靶載體 包含了 部分待剔除的基因片段 、 陽(yáng)性篩選標(biāo)志基因 、 陰性篩選標(biāo)志基因 。 基因敲除技術(shù)的基本過(guò)程： 打靶載體的構(gòu)建： 一般包括三次 DNA體外重組 ①、將待剔除基因作為目的基因克隆到特定克隆載體上； ②、將帶有目的基因的重組載體作為克隆載體，利用合適的內(nèi)切酶將目的基因片段的大部分切除，使目的基因活性足以喪失，然后以此線性載體作為克隆載體，將一個(gè)陽(yáng)性篩選標(biāo)志基因插入連接到目的基因的中段；例如； Neor基因：使細(xì)胞具有抵抗新霉素（ G418）能力。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 基本過(guò)程 ： 真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將外源基因和真核表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒； 在原核細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增和克隆化真核重組表達(dá)質(zhì)粒； 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞； 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆化篩選、保存； 轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的蛋白、提取、鑒定。 一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因的動(dòng)物。 第一節(jié) 利用轉(zhuǎn)基因模型研究基因的功能 利用動(dòng)物模型研究 未知基因的功能 ，就是將某
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