xxxx年本科實(shí)驗(yàn)四 重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定-全文預(yù)覽
【正文】 所有純化方法都是利用了質(zhì)粒 DNA相對較 小及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。 15 15 提取質(zhì)粒 DNA的目的與意義： 基因載體 /基因克隆 /基因工程 提取質(zhì)粒 DNA的常規(guī)方法 (1)SDS堿裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。 9 (1) 超螺旋 DNA (supercoiled DNA, SC DNA) 質(zhì)粒的三種構(gòu)型 10 (2) 開環(huán) DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就能發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。 質(zhì)粒 DNA的制備 限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒 朱文博 中山醫(yī)學(xué)院 基因克隆 ?定義： 經(jīng)無性繁殖獲得基因許多相同拷貝的過程。 ?基因克隆示意圖 載體 DNA(限制性內(nèi)切酶切開 ) 目的基因＋宿主細(xì)胞＋重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞陽性克隆株繁殖表達(dá)分、切 接 轉(zhuǎn) 篩 基因載體 基因工程中常用的載體 (vector)主要包括質(zhì)粒 (plasmid)、 噬菌體 (phage)和 病毒 (virus)柯斯質(zhì)粒 。 在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋形式存在。 14 理想的克隆載體： (1) 分子質(zhì)量小、多拷貝、松弛控制型 ； (2) 具有多種常用的限制酶的單切點(diǎn) ； (3) 能插入較大的外源 DNA片段 ； (4) 具有容易操作的檢測表型 。 根據(jù)質(zhì)粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 純化方法等因素綜合后加以選擇。 高酸中和至中性 變性的染色體 DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物 質(zhì)粒 DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中 純化 RNA酶消化除去 RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì) 主要試劑及作用 溶液 Ⅰ ：由葡萄糖 、 EDTA、 Tris?
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