【正文】 很少單純使用 。 最廣泛使用為碳酸氫鈉 /碳酸 ,其次為磷酸二氫鈉 /磷酸氫二鈉 ， 調(diào)節(jié)二者的比例 ， 配制成不同 pH緩沖液 。 不同種類細胞對 pH 要求不一致 ， 不同生長階段對 pH要求也不同 。 四 、 培養(yǎng)基的控制 1. 培養(yǎng)用水質(zhì) 細胞培養(yǎng)水質(zhì)最低要求電導率在 1X106Ω cm以上 。 無血清培養(yǎng)基提高了培養(yǎng)的質(zhì)量 ， 避免了使用血清帶來的麻煩 ， 產(chǎn)品純化容易 ， 組分穩(wěn)定 ， 可大量配制 。 組成：無機鹽 、 糖 、 氨基酸 、 維生素及其他成分 。 1. 天然培養(yǎng)基 直接取自于動物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基 ， 如血漿凝塊 、 血清 、 淋巴液 、 胚胎浸出液等 。 胰島素起生長素的作用 ， 白蛋白起保護劑作用 。水解乳蛋白和膠原富含氨基酸 。 不同細胞對葡萄糖利用相似 ， 但對氨基酸的利用相差很大 ，不同的細胞過程對氨基酸的需求存在差別 。 抗生素使用對細胞會產(chǎn)生毒性 ， 而且使實驗室保留抗藥性微生物 ， 應加以注意和克服 。 生長基質(zhì) 貯存液濃度 使用濃度 使用方法 多聚賴氨酸 mg/L mg/L 表面包被 纖維連接蛋白 10 mg/ml 1 mg/ml 加入培養(yǎng)液 層粘蛋白 5～ 10 μg/ml 表面包被 韌粘素 75 μg/ml 5～ 15 μg/ml 包被或加入培養(yǎng)液 膠原蛋白 1～ 3 mg/ml mg/ml 表面包被 6． 抗生素 動物細胞培養(yǎng)過程中 ， 由于培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富 ， 很容易被微生物污染 。 貼附細胞生長需要一個支持介質(zhì) ， 采用在培養(yǎng)液中添加或在器皿表面覆蓋生長基質(zhì) ， 幫助細胞的貼附和生長 。 合成培養(yǎng)基偏酸性 ， 為了穩(wěn)定 pH，可用緩沖體系配制 。 機體細胞的 pH范圍為 6－ 8， 血液和體液中 ， 變化范圍很小 。 離體培養(yǎng)的氣體含有 5％ CO2和 95％ 空氣 ， 其中氧濃度為 21％ 。 在培養(yǎng)過程中 ， 根據(jù)細胞種類選擇確定適宜的培養(yǎng)溫度 。 動物細胞對滲透壓有較強的耐受性 ， 常用增減 NaCl的濃度調(diào)整滲透壓 ， 每增加 1mg/ml NaCl， 滲透壓增加 32 mOsm/kg。 二 、 動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境需求 1. 水與滲透壓 細胞生長離不開水 ， 水是細胞反應的重要介質(zhì) 。 胰島素是最常用的激素 ， 促進糖原和脂肪酸的合成 ， 對細胞的生長有刺激作用 。 碳酸鹽緩沖液是重要的體內(nèi)緩沖體系 ， 與 K＋ 、 Cl－ 等在維持酸堿平衡具有重要作用 。 離體培養(yǎng)為細胞提供足夠的 Na和 Cl離子是基本條件 ， 一般生理鹽水的離子濃度 （ % NaCl） 。 維生素 E即生育酚 ， 是抗氧化劑 ， 防止生物膜中磷脂的不飽和脂肪酸被氧化 。維生素 C， 抗壞血酸 ， 在體內(nèi)參與還原反應 、 羥化反應 ，促進膠原蛋白合成和粘多糖合成 ， 抗氧化作用 。 谷氨酰胺還可作為重要的碳源和能源而被利用 。 氨基酸還參與合成一些含氮化合物 ， 核苷酸的四種嘌呤和嘧啶堿基 、 兒茶酚胺等含氮激素及神經(jīng)遞質(zhì)等 。 一 、 動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求 糖類是細胞主要的營養(yǎng)物質(zhì) ， 分解后釋放出能量 ATP。 哺乳動物細胞的選擇標記，使用與之相對應的選擇劑。 方法 表達類型 毒性 細胞類型 特點 磷酸鈣 瞬時 、穩(wěn)定 無 貼壁細胞 ，懸浮細胞 簡單 DEAE葡聚糖 瞬時 有 CV1， COS 簡單 陽離子樹脂 瞬時 、穩(wěn)定 有或無 貼壁 、 原代懸浮細胞 簡單 ， 有效 化學轉(zhuǎn)染的特點 四 、 轉(zhuǎn)染體篩選與分離 轉(zhuǎn)染后 1～ 6天收獲細胞 ， 進行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交 ， 檢測外源基因的瞬時表達 。 磷酸鈣與 DNA形成不溶性沉淀，帶正電荷的 DEAE－葡聚糖與帶負電荷的 DNA磷酸基團結(jié)合，陽離子樹脂包裹DNA形成脂質(zhì)體。 三 、 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染 （ 是將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎募夹g通用名稱 。 對桿狀病毒高度敏感 ， 生長快 ， 能高效表達外源基因 。 COS：是從 SV40 DNA轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細胞 CV1中分離得到的 ， 廣泛用于外源基因瞬時表達的研究 。 Vero：從成年非洲綠猴腎中分離獲得的貼壁型成纖維細胞，多倍體核型，能適應灌流操作，進行連續(xù)培養(yǎng)。 骨髓瘤細胞： J558L是小鼠 BALB/c骨髓瘤細胞 ， 分泌 IgA，用于轉(zhuǎn)染研究 。 BHK21表達的重組凝血因子 Ⅷ 已被獲準上市 。 二氫葉酸還原酶缺陷株表達的藥物有 tPA、 EPO、HBsAg疫苗 、 GCSF、 凝血因子 Ⅷ 、 DNA酶 Ⅰ ， 已上市 。 核型為亞二倍體 ， 分泌表達外源蛋白 ， 而內(nèi)源蛋白分泌很少 。 WI38：二倍體成纖維細胞系 ， 2n=46， 第一個被用于制備疫苗 。 二 、 受體細胞 1． 人源細胞株系 Namalwa：類淋巴母細胞 ， 非整體核型 。 基因的擴增系統(tǒng)： 在逐漸提高選擇壓的情況下，使選擇標記基因拷貝數(shù)增加，并可連帶其兩側(cè)序列一起擴增，從而提高表達基因水平。 組織特異性啟動子：如鼠 、 山羊酪蛋白啟動子 ， 可使基因主要在乳腺中表達 。 順反子在多亞基蛋白的偶聯(lián)表達及其控制策略等方面有廣泛應用前景。 終止序列： AAUAAA或連續(xù)的終止密碼 UGA、 UAA和UAG， 能防止轉(zhuǎn)錄通讀 ， 使轉(zhuǎn)錄在正確的位點結(jié)束 。 噬菌體 T7啟動子比動物基因啟動子表達水平高 。 TATA盒 ， 確定起始位置； GG盒 ， 影響轉(zhuǎn)錄頻率 。 抗生素抗性標記，原核細胞篩選。無感染性和致癌性，可用于構(gòu)建基因工程疫苗。 第二節(jié) 基因工程動物細胞系的構(gòu)建 構(gòu)建高效表達載體 轉(zhuǎn)染動物細胞 篩選鑒定 獲得生產(chǎn)用工程化細胞系 動物細胞的表達載體：病毒載體，質(zhì)粒載體。 2） 外源基因的表達在轉(zhuǎn)染的晚期 ， 大約在 20h后起始基因表達 ， 在 72－ 94h細胞裂解死亡 ， 基因表達時間約 30－50h， 高水平表達不連續(xù)且時間短 ， 這對表達不利 。 4） 高效表達：可容納較大的外源基因 （ 12kb） ， 表達數(shù)個外源基因 ， 并且正確裝配成有功能的分子 。 至少有 600多種昆蟲可以作為宿主 ， 每年有數(shù)百個基因利用昆蟲系統(tǒng)進行表達 ， 越來越成為非常有用的表達宿主 。 苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲細胞表達系統(tǒng) ， 家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲表達系統(tǒng) 。 同時可能有潛在的致病因子 、 免疫原性存在 。 骨髓細胞 MPG－ 11生產(chǎn) IgG的能力為 5pg/(細胞 .分鐘 )，10L反應器 ， 密度為 107/ml， 生產(chǎn)能力不到 1g/d。 原核表達的GM－ CSF雖有活性 ， 但在體內(nèi)產(chǎn)生抗體 。 細胞系 Fuc Gal 唾液酸 α1,6 α 1 , 3 Fuc α1 , 3Gal SO4 GalNAc α 2 ,3 α2,6 糖基化 等分GluNAc BHK ++ 0 + 0 ++ 0 0 CHO ++ 0 0 ++ 0 + 0 鼠雜交瘤 ++ 0 ++ 0 ++ 0 +++ 0 C127 ++ 0 ++ ++ ++ ++ +++ 0 J558L ++ 0 ++ ++ ++ +++ 0 人淋巴細胞 ++ 0 0 0 + + 0 ++ 人垂體 ++ 0 0 +++ + + 0 ++ Namalwa ++ 0 0 0 ++ ++ 人鼠雜交瘤 ++ 0 0 0 + + + 0 2. 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 基因工程哺乳動物細胞系：失去分化能力的無限生長細胞系 ， 即永久性細胞 。 盡管哺乳動物細胞具有細胞內(nèi)的糖基化裝置，但不同細胞系，糖基化特征不同。 細胞特異性糖基化途徑 —— 淋巴細胞中進行 ， 它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體 。 O糖基化只在高爾基體上進行 ， 糖基單元有木糖 、 葡萄糖 。 雜合型至少含有一條復合糖鏈 ， 另一個鏈含有甘露糖 。 如果 X為 Trp、 Asp、 Glu和 Leu， 對糖基化有負影響 ， 而第三位 Thr能增強糖基化 。 糖蛋白的單糖單元 :αD葡萄糖 、 αD半乳糖 、 αD甘露糖 、 αD木糖 、 αD巖藻糖 、 N乙酰 αD葡萄糖胺 、 N乙酰 αD半乳糖胺和 αN乙酰神經(jīng)氨酸 （ 或唾液酸 ） 。能量是以 ATP和NADPH的形式提供，來源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二種細胞系對各個代謝途徑的貢獻和所起的作用不同。在快速生長的動物細胞培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)氨作用是主要的代謝途徑。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。小部分（ 4％～ 8％）葡萄糖進入戊糖磷酸途徑，把葡萄糖轉(zhuǎn)化為 7碳糖和還原力NADPH， 5碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。 葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以補償 ， 反之亦然 。 亞細胞器 ， 功能獨特 。 干擾素 、 單克隆抗體 、 重組基因工程產(chǎn)品 ?；蚬こ虅游锛毎囵B(yǎng)制藥工藝 藥用蛋白質(zhì)的合成復雜 ， 要有精確折疊的空間結(jié)構(gòu) ，要有糖基化 ， 才能使藥物發(fā)揮真正的功能 。 人畜病毒疫苗 :口蹄疫苗 、 狂犬病疫苗 、 牛白血病和脊髓灰質(zhì)炎 、 乙肝疫苗 。 一 、 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)與特征 1. 動物細胞的特征 細胞膜 、 細胞質(zhì) 和細胞核 沒有細胞壁 。 在動物細胞培養(yǎng)中 ， 葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作為合成代謝的前體 ， 因此動物細胞的培養(yǎng)具有一定的靈活性 。 丙酮酸還可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A，進入三羧酸循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生 CO2和水。 大多數(shù)谷氨酰胺在脫氨酶催化下，生成谷氨酸，并釋放氨，對細胞產(chǎn)生毒性。谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進入培養(yǎng)液并積累。 在連續(xù)細胞系中，沒有這種流動。 而蛋白質(zhì)的糖基化無需模板指導 ， 因此糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化 。 N糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上 ， 其模體的保守序列為 AsnXThr/Ser (X為除脯氨酸以外的任意氨基酸 )。 復合型含有 2個以上支鏈 ， 如乙酰半乳糖胺 、 果糖和唾液酸等 。 O糖基化比較小 ， 一般為 1～ 6個寡聚糖 ， 但比 N糖基化變化更大 。 在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白時 ， 磷脂酶 C可切割此類蛋白 ，有利于純化 。 促黃體激素 、 促甲狀腺素等的硫酸化只能在垂體中發(fā)生 。 要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細胞系。 原核細胞表達的 EPO無糖基化 ， 在體內(nèi)表現(xiàn)無活性 。 表達系統(tǒng) O糖基化 寡聚甘露糖 高甘露糖 復合體 大腸桿菌 0 0 0 0 釀酒酵母 ＋＋ 0 ＋＋＋＋ － 昆蟲 Sf9 ＋＋ ＋＋＋＋ 0 － 倉鼠 CHO ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 倉鼠 BHK ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 鼠雜交瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 鼠骨髓瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ C127 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ J558L ＋＋ － 0 ＋＋ 人淋巴細胞 ＋＋ 0 0 ＋