基因工程制藥技術(shù)-全文預(yù)覽
【正文】 生干擾素制備工藝： Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)工藝路線（ 1）l1989年： IFNαn3/Alferon，批準(zhǔn)上市l(wèi)產(chǎn)量低： 1g從供應(yīng)量和需要量（菌體生長(zhǎng)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個(gè)方面考慮，使之需氧不超過(guò)設(shè)備的供氧能力考慮溶氧對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量四 重組人干擾素生產(chǎn)工藝l 概念：（ interferon， IFN）? 機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的細(xì)胞因子l 功能：干擾病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖l 天然干擾素分類：? ?? I干擾素： IFNα、 IFNβ、 IFNτ、 IFNε、 IFNω? ?? II干擾素： IFNγl 上市重組干擾素 :乙酸 的產(chǎn)生使菌體生長(zhǎng)速率下降，也抑制基因表達(dá)。溫度控制pH值對(duì)發(fā)酵的影響細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜 pH為 ～ ，真菌喜歡微酸性：酵母適宜 pH為 ～ 。? 甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母：加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)l溫度l溶解氧lpH大腸桿菌和釀酒酵母生長(zhǎng)最低溫度為 10℃大腸桿菌生長(zhǎng)最適溫度為 37℃ ，最高溫度為 45℃ 。l發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中質(zhì)粒容易丟失，使之成為宿主菌為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不丟失 ， 根據(jù)質(zhì)粒上的營(yíng)養(yǎng)缺陷或選擇性標(biāo)記基因，添加或缺陷選擇劑。l不同工程菌對(duì)氮源利用能力差異很大，具有很高的選擇性。l濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。但這種方法能獲得相當(dāng)量的重組水蛭素，所以極大地推動(dòng)了水蛭素的藥理、臨床等方面研究工作的深人開(kāi)展?；蚬こ探湍傅膽?yīng)用? 1981年 Hitzman等：酵母表達(dá)人干擾素l激素類： 6種人胰島素及 1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素 ； 細(xì)胞因子： GMCSF和血小板衍生生長(zhǎng)因子l多肽類：高血糖素l2種乙肝疫苗等。? 培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。2融合蛋白、 OspA脂蛋白（疫苗）等PEG? 聚乙二醇（ PEG）是中性、無(wú)毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相容性的高分子聚合物，也是經(jīng) FDA批準(zhǔn)的極少數(shù)能作為體內(nèi)注射藥用的合成聚合物之一。裂殖。菌落原位雜交的原理 鑒定方法? 菌落 PCR： 是否 含有目標(biāo)基因? 載體大?。弘娪緳z測(cè)? 酶切鑒定：插入 片段大小 及插入方向? 測(cè)序確證：目標(biāo)基因的序列準(zhǔn)確無(wú)誤，閱讀框架通讀二 基因工程菌的構(gòu)建? 基因工程菌： 微生物為操作對(duì)象，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的表達(dá)外源基因或過(guò)量或抑制表達(dá)自身基因的工程生物體。 能使人工底物 Xgal變成藍(lán)色 , 產(chǎn)生藍(lán)色菌斑或菌落。這種載體適用于可編碼 β半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。（ 1） 遺傳學(xué)方法? A. 抗生素篩選法? a. 單抗生素篩選? 大多數(shù)克隆載體帶有抗生素抗性基因，如氨芐青霉素（ ampicillin, Amp）、 四環(huán)素 (tetracycline,Tet)、 卡那霉素 (kanamycin, Kan)抗性基因。TrisHCl,Taq聚合酶，耐高溫l緩沖溶液： 50l外源基因表達(dá)盒 (操縱子模型 )：目標(biāo)基因 PCR定位克隆PCR循環(huán)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成l模板 DNA：目標(biāo)序列 ,100－ 10vector在質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點(diǎn)處插入外源基因表達(dá)盒所構(gòu)成。l脫氧核苷酸： 4種 dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPlDNA聚合酶 :mM 所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫
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