【正文】 加入值 )A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求 —— 相對回收率應(yīng)在 85%～ 115% (LOQ附近 80%～ 120%) —— RE在 177。 20%的范圍內(nèi) ) —— RSD＜ 20% 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 50 體內(nèi)藥物分析 六、穩(wěn)定性與質(zhì)量控制 穩(wěn)定性 —— 包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性 方法穩(wěn)定性 —— 方法的耐用性 樣品穩(wěn)定性 —— 生物樣品的存放條件和時間 、 凍 融循環(huán) 測定法 —— QC樣品穿插于實際樣品測定全過程 —— 模擬 (或?qū)嶋H )生物樣品及其預(yù)處理后的待測溶液進行考察 要求 —— 準確度 85%～ 115%(RE在 177。 初步擬定 ：采用 RPHPLC法 2． 檢測方法 紫外 —— 靈敏度＜ 1ng， 若取血漿 ， 采用 3倍量乙腈沉淀蛋白 ， 取上清液 100?l進樣 ， 則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在 50ng/ml以上 ，當(dāng) Cmax在 2?g/ml以上 (口服 500mg)時 基本可滿足 生物等效性研究要求 熒光 —— 靈敏度＜ ， 能 滿足 本試驗要求 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 58 體內(nèi)藥物分析 二、分析方法設(shè)計（續(xù)） 3． 樣品制備方法 初步擬定 —— 采用簡便 、 快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進樣分析 預(yù)試 —— 含 75%乙腈的提取液 100?l進樣后 ， 色譜峰理論板數(shù) 、對稱性下降 (前沿峰 )， 進而導(dǎo)致檢測靈敏度降低 (峰高降低 ) 經(jīng)進一步試驗 ， 確定為： 血漿 → 乙腈 1ml沉淀蛋白 → 二氯甲烷 異丙醇 (95:5)5ml萃取→ 60℃ 氮氣流吹干 → 流動相 200?l溶解 → 20?l進樣 靈敏度可達 2ng/ml(血漿濃度 )， 符合要求 (Cmax＞ 2?g/ml) 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 59 體內(nèi)藥物分析 三、實驗方案 1． 給藥方案 20名受試者隨機分為兩組 ， 每組 10人 第 1次試驗 —— 第一組口服受試制劑 (相當(dāng)于環(huán)丙沙星500mg)， 第二組口服相同劑量的參比制劑 第 2次試驗 —— 第 1次服藥后第 7天開始 ， 兩組交換給藥 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 60 體內(nèi)藥物分析 三、實驗方案（續(xù)） 2． 血樣的采集與處理 分別口服給藥前和給藥后 、 、 、 (tmax)、 、 、 、 、 (5~7個 t1/2)小時 由肘正中靜脈取血 4 ml 立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中 ， 靜置 5分鐘后 ， 離心 15分鐘(3000rpm)， 分離血漿 20℃ 冰箱中保存待測 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 61 體內(nèi)藥物分析 三、實驗方案（續(xù)） 3． 血樣分析法 色譜條件 —— 高效液相色譜儀 (包括 LC10ATvp泵 ， RF530熒光檢測器 )；色譜柱為 Kromasil ODSAP(200mm mm， 5?m) —— 流動相為乙腈 (86:14)， 流速 —— 檢測波長為 ?ex=277nm， ?em=445nm —— 柱溫為 40℃ 。 原子吸收光度法 （ AA） 1 + 薄層掃描法 （ TLSC） 紫外檢測器 （ UV） 10 ++ 熒光檢測器 （ Fluor） 1 ++ 氣相色譜法 （ GC） 氫火焰離子化檢測器 （ FID） 1～ 10 ++ 氮磷檢測器 （ NPD） ～ +++ 電子捕獲檢測器 （ ECD） +++ 質(zhì)量碎片選擇離子檢測器 （ MS） ++++ 高效液相色譜法 （ HPLC） 紫外檢測器 （ UV） 1 ++ 熒光檢測器 （ Fluor） +++ 電化學(xué)檢測器 （ ECD） ～ +++ 免疫法 （ IA） 放射免疫法 （ RIA） ++ 酶免疫法 （ EIA） ++ 熒光免役法 （ FIA） ++ 3/5/2023 70 體內(nèi)藥物分析 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。故不認為代謝物有干擾 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 64 體內(nèi)藥物分析 四、分析方法驗證 (續(xù) ) 2． 標準曲線 標準系列溶液 —— 取鹽酸環(huán)丙沙星 ， 加水制成 20和 50?g/ml的標準系列溶液 ， 冰箱保存 標準系列模擬血漿樣品 —— 取空白血漿 ， 加環(huán)丙沙星標準系列溶液各 50?l， 配制成相當(dāng)于濃度為 ， 、 、 、 、 ?g/ml的 QC樣品 ， 冰凍 (20℃ ) 測定法 —— 取 QC樣品 ， 照 “ 血漿樣品的預(yù)處理 ” 項下方法操作 ，以環(huán)丙沙星濃度 C為橫坐標 ， 環(huán)丙沙星與內(nèi)標物質(zhì)的峰面積比值 Y為縱坐標 ， 用加權(quán)最小二乘法經(jīng) Excel運算 ， 求得的直線回歸方程為：Y= 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 54 體內(nèi)藥物分析 第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析方法 應(yīng)用示例 第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥 鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性 研究 一 、 文獻調(diào)研 性質(zhì) —— 在水中溶解 ， 在甲醇中微溶 ， 在乙醇中極微溶解 ， 在氯仿中幾乎不溶 ， 在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶 ，在乙醇 、 二氯甲烷中極微溶解 ， 在稀醋酸中溶解 。 20%) ）（ %100?? AMRR ）（）（ %100%100 ????? RRA AMRE第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 44 體內(nèi)藥物分析 四、精密度 方法精密度 (precision ) —— 系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的 偏離程度 —— 表示該分析方法的 可重復(fù)性 (reproducibility) —— 反映分析方法的 可操作 性 ， 是方法驗證的基本要點之一 實際生物樣品的量有限 (如血漿 ， 一般為 ～ 2ml) —— 使用模擬生物樣品測定 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 45 體內(nèi)藥物分析 1. 表示方法 方法精密度一般用標準偏差 (standard deviation， SD)或 相對標準偏差 (relative standard deviation， RSD)表示 SD= RSD= = —— 包括批內(nèi) (withinrun或 intraassay)RSD— 日內(nèi) (withinday) 和批間 (betweenrun或 interassay)RSD— 日間 (betweenday， daytoday) ? ?112?????nXXniii）（ %100?XSD? ?）（ %100112??????XnXXniii第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 46 體內(nèi)藥物分析 2. 測定法 —— 分別測定法 (Ⅰ ) 照準確度項下方法 ， 取空白生物基質(zhì) (如血漿 )數(shù)份 ， 分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高 、 中 、 低 3個濃度的 QC樣品 ， 并分析測定 批內(nèi) RSD —— 每一濃度 5～ 6個樣品 ， 每個樣品測定 1次 ， 用隨行標準曲線分別計算 3個濃度及每 1濃度的 RSD 批間 RSD —— 每 1分析批內(nèi)每一濃度制備 1個樣品 ， 每個樣品測定 1次；用隨行標準曲線計算 3個濃度 (每一濃度 5～ 6個分析批數(shù)據(jù) )的 RSD 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 47 體內(nèi)藥物分析 2. 測定法 —— 連續(xù)測定法 (Ⅱ) 若實際樣品測定所用的分析批次少于 5批 ， 也可進行 3個批次的連續(xù)分析 (每 1濃度的每 1批次為 5～ 6個樣本 )—— 方差分析法 批間 RSD = 批內(nèi) RSD = = (%)1001)((%)100112???????????????XIXXnXISSIiiA）（ %100(%)100 ?????????? XINSSSSXINSS Atote）（）（%100)(1 1212???????? ???????? ??XINXXnXXIiIiinjij第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 48 體內(nèi)藥物分析 3. 限度要求 在藥代動力學(xué)和生物利用度研究中 對 ?g/ml級水平的 RSD一般應(yīng)