【正文】 (126~132℃ ) 。培養(yǎng)基配制后，經(jīng)預(yù)熱，用連消泵送入連消塔底部，被直接蒸汽加熱到 126~132 ℃ ， 再由連消塔 頂部排出，進入維持罐，在110~130 ℃ 保溫 5~7 min，由維持罐上部側(cè)面流出，經(jīng)冷卻器冷卻至發(fā)酵溫度，送入滅菌發(fā)酵罐 四、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌 88 ? (1) 預(yù)熱 ? 目的： 減少冷凝水產(chǎn)生和避免料液與蒸汽溫度相差過大在加熱器中產(chǎn)生水汽撞擊聲。 ? 連續(xù)滅菌工藝的優(yōu)點是： ? 可采用高溫快速滅菌方法，營養(yǎng)成分破壞少； ? 組成培養(yǎng)基的耐熱性物料和不耐熱性物料可分開在不同溫度下滅菌，以減少物料的破壞； 四、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌 85 ? 也可將糖和氮源分開滅菌，以免醛基與氨基發(fā)生反應(yīng)，防止有害物質(zhì)生成； ? 發(fā)酵罐非生產(chǎn)占用時間短，容積利用率高； ? 熱能利用合理，適合自動化控制； ? 蒸汽用量平穩(wěn)。 缺點 ? 加熱和冷卻時間較長，營養(yǎng)成分有一定的損失； ? 罐利用率低； ? 不能采用高溫快速滅菌工藝； ? 在滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大； ? 冷卻水用量大。 ? 培養(yǎng)基分批滅菌時，發(fā)酵罐容積越大，加熱和冷卻時間就越長。 81 ? 冷卻降溫： ? 為了減少營養(yǎng)成分的破壞，多采用 快速冷卻 方式。 ? 開啟 ? 排氣管閥 ? 進料管 (補料管 ) ? 接種管排氣閥 ? 消泡劑管 ? 排氣。 ? 預(yù)熱 ： 培養(yǎng)基在攪拌狀態(tài)下， 排放夾套或蛇管中的冷水，開啟排氣管閥，在夾套或蛇管內(nèi)緩慢通入蒸汽以預(yù)熱料液，當發(fā)酵罐的溫度預(yù)熱至 80~90℃ ，關(guān)閉夾套或蛇管蒸汽閥門 。 ? 全程包括 加熱 、 維持 、 冷卻 三個過程。因為冷空氣導(dǎo)熱性差，阻礙蒸汽接觸欲滅菌物品。 ? 培養(yǎng)基中微生物數(shù)量越多，達到無菌要求所需的滅菌時間也越長。 ? 越濃稠的培養(yǎng)基滅菌所需時間越長。 ? 溫度 孢子數(shù) 滅菌時間 (min) ? (℃ ) (個 /ml) pH= ? 120 10000 8 7 5 3 3 ? 115 10000 25 25 16 13 13 ? 110 10000 70 65 35 30 24 ? 100 10000 740 720 180 150 150 73 二、影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素 ? 培養(yǎng)基的物理狀態(tài) ? 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對滅菌有極大的影響。 ? 在固形物含量高的情況下，滅菌溫度要高些。 ? 采用高溫快速滅菌方法，既可殺死培養(yǎng)基中的全部有生命的有機體，又可減少營養(yǎng)成分的破壞。 ＞ E： 菌體死亡所需活化能 E39。： 營養(yǎng)成分破壞所需活化能 一、溫度和時間對培養(yǎng)基滅菌的影響 RTEeAk /????k1 k2 k k 68 ? 由于殺死微生物的 E＞營養(yǎng)成分破壞的 E ′，因此， ? 即隨溫度上升，滅菌反應(yīng)速度常數(shù)的增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分破壞速度常數(shù)的增加倍數(shù)。 E 67 2. 為滅菌溫度和滅菌時間的選擇提供依據(jù)和指導(dǎo) 由 ，加熱滅菌時， 滅菌溫度發(fā)生變化 ，熱致死速度常數(shù) k 值和培養(yǎng)基成分分解反應(yīng)速度常數(shù) k39。)和 A(A39。 64 ? 熱滅菌致菌體死亡 也是一級動力學反應(yīng)， 熱致死速度常數(shù) 與溫度的關(guān)系也可用阿累尼烏斯方程式表示： ? 式中 A滅菌反應(yīng)的阿累尼烏斯常數(shù) (1/s ) ΔE‘滅菌反應(yīng)所需的活化能 (J/mol)； 前兩式取對數(shù)，則得： 營養(yǎng)成分的破壞方程式 菌體死亡方程式 RTEeAk /????一、溫度和時間對培養(yǎng)基滅菌的影響 k k 65 ? 阿累尼烏斯方程式的意義： 1. 反應(yīng)了反應(yīng)速度常數(shù) k 39。 39。滅菌溫度和時間的確定取決于： ? （ 1）雜菌孢子的熱滅死動力學； ? （ 2）反應(yīng)器的形式和操作方式； ? （ 3）培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍。 59 問題怎么這么多？ ? 連消與實消各有何優(yōu)缺點？ ? 影響培養(yǎng)基滅菌因素有哪些？ ? 如何計算培養(yǎng)基滅菌時間？ ? 怎樣做到既要滅菌目的又要保護培養(yǎng)基營養(yǎng)成分最少破壞？ ? 實消的過程要點和控制參數(shù)？ ? 連消的過程要點和設(shè)備組成？ 60 一、溫度和時間對培養(yǎng)基滅菌的影響 ? 用濕熱滅菌方法對培養(yǎng)基滅菌，在殺滅微生物的同時，也會對營養(yǎng)成分造成破壞。 ? 如果要將雜菌完全除盡，即 NL=0，濾層厚度需要無窮大，事實上是不可能的。 ? 2） 介質(zhì)的填充厚度與密度： 對于相同的介質(zhì)，填充厚度和密度越大則過濾效率越高，但同時流速也越小。 ? 空氣溫度 20℃ ，微粒重度 γp=時，通過不同直徑的纖維過濾層的空氣的臨界速度 (Vc)見右圖 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 53 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 ? 空氣過濾后的微粒數(shù)與過濾前的微粒數(shù)的比值稱為穿透率 P，則 ? P = —— ? 式中 N0— 過濾前空氣中的微粒含量 (個 )； ? Nt— 過濾后空氣中的微粒含量 (個 )。 ? 過濾效率就是濾層所濾去的微粒數(shù)與原有微粒數(shù)的比值 ， 它是衡量過濾設(shè)備過濾能力的指標 。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 51 ? 在過濾除菌中 ， 有時很難分辨上述各種機理各自所做出貢獻的大小 ， 多是 五種作用的綜合結(jié)果 。懸浮在空氣中的微生物顆粒大多帶有不同的電荷。 ? 直徑 50μm以上的顆粒沉降作用比較顯著，小顆粒只有在氣流速度很慢時才有沉降作用。結(jié)果使較小的微粒聚集成為較大的微粒，增加了與纖維接觸的機會，當與纖維接觸時就被捕集，這種作用叫做 擴散 。 ? 微生物微粒直徑很小，質(zhì)量很輕，當隨低速氣流流動靠近纖維時，微粒所在的主導(dǎo)氣流流線受纖維阻礙而改變力向，繞過纖維前進，并在纖維的周邊形成一層邊界滯留區(qū)。 ? 這種慣性沖擊作用的程度取決于微粒的動能、纖維阻力、氣流速度。 ? 帶微粒的空氣流過纖維濾層時， 懸浮于空氣中的微生物菌體何以能被過濾除去呢？ 45 ?當氣流為層流時，氣體中的微粒隨空氣做平行運動，接近纖維表面的微粒 (指在流動空氣寬度 b內(nèi)的微粒 )被纖維捕獲，而寬度大于 b的氣流中的微粒繞過纖維繼續(xù)前進。 ? 常用的濾材介質(zhì)有棉花、棒狀活性炭、石棉板、超細玻璃纖維紙、燒結(jié)玻璃、粉末燒結(jié)金屬、硝酸纖維酯類物質(zhì)、多孔陶瓷、聚四氟乙烯薄膜、聚砜、尼龍膜等。細菌的大小為零點幾微米至幾微米，這些微生物在空氣中極少單獨游離存在，基本都是附著在灰塵、液滴等微粒的表面上。 ? 絕對過濾易于控制過濾后空氣質(zhì)量，節(jié)約能量和時間，操作簡便。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 絕對過濾 深層過濾 40 絕對過濾 ? 絕對過濾最常用的過濾材料是微孔濾膜。 39 ? 八、介質(zhì)過濾除菌 ? 要去除液體或氣體中的微生物以達到無菌要求，可以使用適當?shù)牟牧线M行過濾，這種方法只能用于澄清流體的除菌。 ④ 臭氧制備是利用我們周圍的大氣制取 (現(xiàn)有成型產(chǎn)品：臭氧發(fā)生器），現(xiàn)制現(xiàn)用，不需儲藏設(shè)施，節(jié)省原料儲儲所需的占地面積。 ② 臭氧滅菌為溶菌級方法，殺菌徹底。 36 ? 七、臭氧（ O3）滅菌 ? 臭氧是一種強 氧化劑 ，滅菌過程屬生物化學氧化反應(yīng)。一般當電極板上塵厚 1mm時，就應(yīng)該用噴水管自動噴水清洗，洗凈干燥后重新投入使用。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 33 六、靜電除菌 ? 靜電除菌是利用靜電引力來吸附帶電粒子而達到除塵滅菌的目的 。 常用的化學藥劑： 甲醛、氯 (或次氯酸鈉 )、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷、苯酚、季氨鹽 (如新潔爾滅 )、氯化汞等。但紫外線的穿透力很低，僅適用于表面和局部空間滅菌，如臺面、潔凈室、更衣室等。的紫外線有滅菌作用，最常用的波長 2537197。 α射線、 X射線、 β射線、 γ射線、紫外線、超聲波等從理論上講都能破壞蛋白質(zhì)，破壞生物活性物質(zhì)，從而起到殺菌作用。 ? 常用滅菌條件： 160℃ 下保溫 1~2 h。 ? 在相同的滅菌條件下，各種微生物的 k值是不同的， k值愈小，表明這種微生物的熱阻愈大，越耐熱 。 K= (min－ 1) t = K lg N0 N = lg (8 1015) = (min) 25 ② 如以活菌殘留率的對數(shù) 與滅菌時間 t的實測值作圖，得出的殘留曲線在一定的時間范圍內(nèi)為直線，其斜率為 k/， k值隨菌株及滅菌溫度而異。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 soNNKt lo g13 0 ?t k 24 ? 例：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝 40m3培養(yǎng)基，在 121℃ 溫度下進行實罐滅菌。 ? 因此配制培養(yǎng)基所用原料要含雜菌少，培養(yǎng)基配制后要盡快滅菌，以減少雜菌的生長。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 kNdtdN ??22 ? 開始滅菌時，即 t=0時，培養(yǎng)基中活菌數(shù)為 N0。 ? 熱阻： 指微生物在某一種特定條件下（主要指溫度和加熱方式）的致死時間。 ? 同種微生物的營養(yǎng)體、芽孢和胞子的結(jié)構(gòu)不同，對熱的抵抗力也不同，致死溫度和致死時間也有很大的差別。熱滅菌即是利用微生物的這一特性進行的。 ? 注意： 將飽和蒸汽通入培養(yǎng)基中滅菌時，冷凝水會使培養(yǎng)基的濃度下降，所以在配制培養(yǎng)基時應(yīng)扣除冷凝水的體積，以保證培養(yǎng)基在滅菌后保持應(yīng)有的濃度。 14 ? 二、高溫濕熱滅菌 ? 的物品以殺死微生物。最重要的化學治療劑如各種抗生素、磺胺類藥物和中草藥中的有效成分等。 11 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 ? 防腐： 就是利用某種理化因素 完全抑制霉腐微生物的生長繁殖 ，從而達到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。 7 第二節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 有問題嗎？ ? 詞解：滅菌：消毒：防腐：化療：致死溫度： 致死時間：熱阻：相對熱阻： ? 消毒與滅菌的概念及區(qū)別 ? 8 ? 工業(yè)生產(chǎn)中常用的滅菌方法有哪些？原理？應(yīng)用范圍？優(yōu)缺點？ ? 濕熱滅菌原理？滅菌徹底與否以何為標準？ ? 如何計算滅菌時間？對數(shù)殘留定律的意義有哪些？k值的意義？ ? 如何確定滅菌溫度？阿累尼烏斯方程式的意義？高溫短時滅菌方法的意義？ ? 為什么干熱滅菌與濕熱滅菌相比溫度高？時間長？ 9 一、常用滅菌方法 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 10 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 ? 滅菌： 是利用 物理或化學的方法 殺滅或去除 物料或設(shè)備中 所有的有生命的有機體 的 技術(shù) 或 工藝過程 。 ?發(fā)酵使用的培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣過濾器、附屬設(shè)備、管路、閥門以及通入罐內(nèi)的空氣，在使用前均需徹底滅菌或除菌，這是防止發(fā)酵過程染菌、確保正常生產(chǎn)的關(guān)鍵。1 第四章 滅菌 與 除菌 2 ?在當前的發(fā)酵工業(yè)中，絕大多數(shù)的發(fā)酵過程屬于 需氧的純種發(fā)酵 。 ?染菌會給發(fā)酵帶來很多負面影響，輕則影響產(chǎn)物的產(chǎn)量，或使產(chǎn)物的提取變得困難，造成產(chǎn)品質(zhì)量下降或收率降低，重則導(dǎo)致產(chǎn)物全部損失，所以染菌是工業(yè)發(fā)酵的“大敵”。 ? 這是防止發(fā)酵過程染菌、確保正常生產(chǎn)的關(guān)鍵。 ? 除菌： 是指用過濾方法除去空氣或液體中所有的微生物及其孢子。 ? 用于化療目的的化學物質(zhì)稱化學治療劑。 超高溫加熱瞬時法 (UHT法 ，120~150℃ 、 1~4秒 ) ，而成為今日牛乳殺菌法的主流，此有牛乳中乳清蛋白增進變性之虞。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 15 ? 濕熱滅菌優(yōu)點： ? ①蒸汽來源方便，操作簡單，價格低廉，本身無毒； ? ②蒸汽有強的穿透力 (能殺死耐熱的芽孢桿菌 )和很大的潛熱，滅菌效果可靠； 因此被 廣泛用于工業(yè)生產(chǎn) 。當溫度超過最適生長溫度的上限時，細胞中的蛋白質(zhì)會發(fā)生不可逆的凝固變性，在很短時間內(nèi)引起死亡。 ? 對于同種微生物，在致死溫度范圍，溫度愈高，致死時間就愈短。 19 ? 微生物對熱的抵抗力常用“熱阻”表示。 20 ? 某些微生物的相對熱阻及對一些滅菌劑的相對抵抗力 (與大腸桿菌相比較 ) 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 滅菌方式 大腸桿菌