【正文】 7． 如有孔沒有被加滿或吸干液體，可使用洗板機(jī)清洗保養(yǎng)程序。4． 用仔細(xì)檢查每個(gè)孔是否均注滿，再放入載板位，按IN/OUT按鈕。1．在主屏點(diǎn)擊 Maintenance 圖標(biāo)的History ，輸入用戶名 OK 2．進(jìn)入 Maintenance History 窗口，顯示當(dāng)前儀器保養(yǎng)情況和下次保養(yǎng)時(shí)間。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊每一孔，可看每一孔的詳細(xì)信息。其中R代表試管，S代表校準(zhǔn)品，D代表稀釋微管，P代表位置。（九）查看加樣圖加樣圖是一812的矩陣圖，對(duì)應(yīng)微孔板的每一孔。注意：出現(xiàn)問題后，下次運(yùn)行之前請(qǐng)重新啟動(dòng)系統(tǒng)。確認(rèn)吸嘴、稀釋杯、防蒸發(fā)帽是否已經(jīng)放好，各瓶液量足夠、廢液瓶有足夠的空間等。檢查是否達(dá)到屏幕所示的最低限度液體量。4．放好所有試劑后，按 OK 鍵，條形碼開始讀取試劑條碼，完成后提示裝載微孔板。在條形碼上還標(biāo)有微孔板的編號(hào)，用來定義相應(yīng)的微孔板。6． 在裝載板時(shí)，系統(tǒng)檢查每一次板的支架在孵育器中的位置，如有問題，則該板就不能被裝入，并需要重新運(yùn)行系統(tǒng)，啟動(dòng)程序會(huì)把支架重新帶入孵育器中。4． 待微孔板支架到位后，依列表順序?qū)⒌谝粔K微孔板放到支架內(nèi)，微孔板的條形碼向右（A板條在右邊），然后按IN/OUT鍵，系統(tǒng)自動(dòng)將微孔板送進(jìn)溫育器內(nèi)。在每行前面的紅箭頭表示正在裝載的微孔板。黃色表示測(cè)試板的加樣時(shí)間、深蘭色表示孵育時(shí)間、淺蘭色表示稀釋時(shí)間或預(yù)處理時(shí)間、紅色表示清洗、加液等時(shí)間。待儀器對(duì)其他孔完成吸樣后，系統(tǒng)提示手工加樣到呈深蘭色的空孔，操作者拿出板加樣，要求每孔加樣時(shí)間不超過2分10秒，在屏幕上顯示倒計(jì)時(shí)，完成手工加樣后，按IN/OUT按鈕，或按OK 以確認(rèn)已手工吸樣。 待質(zhì)控架檢測(cè)完成后自動(dòng)退出，放于樣本處理器中央的特定位置，關(guān)上蓋后按Load鍵，儀器自動(dòng)裝載樣品架。3．2．7 結(jié)束創(chuàng)建工作表工作表創(chuàng)建完成后，按儀器上的Load按扭裝載樣品，然后鼠標(biāo)點(diǎn)擊屏幕上的 Close ， 結(jié)束創(chuàng)建工作表，此時(shí)系統(tǒng)會(huì)顯示出校準(zhǔn)品圖，裝載校準(zhǔn)品。2．在微孔板圖左下方顯示實(shí)驗(yàn)板總數(shù)、當(dāng)前第幾塊板和在浮育器中的位置、試劑盒的總數(shù)及位置。14．增加管：Add tubes顯示除樣品外的其他和該待測(cè)樣品有關(guān)的試管數(shù)，如稀釋管、微管等。否則只吸取稀釋樣品。如果樣品處理器類型為1297014，必須在稀釋管槽內(nèi)從右到左依次放入稀釋微管。10．必要時(shí)，在Sample 對(duì)話框的Factor欄中輸入稀釋倍數(shù)（5100），按Accept鍵。8．已經(jīng)確認(rèn)后也能增加測(cè)試樣本。5．在Sample 對(duì)話框的Code區(qū)輸入相應(yīng)的樣本ID號(hào)，連續(xù)樣本以2個(gè)點(diǎn)（..）連接起始ID號(hào)與未尾ID號(hào)，即xx..xxx 。4． 選擇合適的運(yùn)行序號(hào)，按OK 。3．2．5 項(xiàng)目和樣品1． 在Analytes amp。如把73號(hào)改成40號(hào)，則40架號(hào)成為質(zhì)控架而原質(zhì)控架73號(hào)變成普通的樣品架73。3．在屏幕試管架圖最后一排編號(hào)為73的單獨(dú)試管架，是質(zhì)控架，如已在檢驗(yàn)項(xiàng)目中設(shè)置了質(zhì)控品，則自動(dòng)顯示在質(zhì)控架上。注意要確保選擇的位置與試管架上樣品的實(shí)際位置對(duì)應(yīng)。（如果試管已經(jīng)放入樣品處理器中，則不能添加項(xiàng)目）。 運(yùn)行三、運(yùn)行1 工作前準(zhǔn)備（二）創(chuàng)建工作表在以上準(zhǔn)備工作完成后，有兩種方法檢測(cè)。在屏幕下部的測(cè)試板圖上已顯示有校準(zhǔn)品。在標(biāo)準(zhǔn)抽屜內(nèi)一次最多可放8個(gè)項(xiàng)目的校準(zhǔn)品。 在Assay Protocol Editor對(duì)話框輸入校準(zhǔn)品批號(hào)，輸入正確的校準(zhǔn)品濃度值。雙標(biāo)有AProtocol和BProtocol兩種協(xié)議，要更改Bprotocol的濃度值，點(diǎn)擊屏幕右下角的 Bprotocol 鍵。：有7種不同的選擇，在屏幕左邊從上到下依次是①每一測(cè)試塊均做標(biāo)準(zhǔn)曲線；②第一塊測(cè)試板做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其余的做兩點(diǎn)校正；③第一塊測(cè)試板做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其余不做校正和校準(zhǔn)；④每一測(cè)試板均做兩點(diǎn)校正；⑤第一塊測(cè)試板做兩點(diǎn)校正，其余不做校正和校準(zhǔn)；⑥不做校正和校準(zhǔn)，使用上一次標(biāo)準(zhǔn)曲線；⑦不做校正和校準(zhǔn)，使用MultiCalc中設(shè)定的參考曲線。1．在主界面鼠標(biāo)點(diǎn)擊Settings菜單，選擇Assay protocols → 如 Screening → AFPBHCG → Edit 。 若欲將結(jié)果存到LIS系統(tǒng)中，確認(rèn)在MultiCalc中Protocol的 Stored Files里選擇Results，并選擇Resulte格式。（二）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 分析參數(shù)設(shè)置程序1 檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置 在操作主界面點(diǎn)擊Settings菜單 → 選擇Assay Protocols（檢驗(yàn)項(xiàng)目）。 用探針支架支撐探針架防止損壞，關(guān)閉樣品處理器電源。 校準(zhǔn)品：，輕輕混勻，30min后去除泡沫使用。 確認(rèn)傳送器下方的廢物盤已倒空。 點(diǎn)擊Maintenance → Plate Processor → Washer test，檢查洗板機(jī)功能，系統(tǒng)自動(dòng)提示檢查步驟。不能使用多個(gè)稀釋杯。 樣品處理器準(zhǔn)備 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (沖洗液瓶)分別注入足夠用量的清洗液和去離子水，倒空廢液瓶。Auto DELFIA workstation軟件用于控制Auto DELFIA的運(yùn)行，MultiCalc的主要功能是與主機(jī)通訊，對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和對(duì)質(zhì)控及其他數(shù)據(jù)處理（可通過雙擊屏幕上圖標(biāo)不運(yùn)行）。（一）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 開/關(guān)程序1 開機(jī) 依次打開樣品處理器電源，微孔板處理器電源，打印機(jī)電源。它利用具有長效熒光的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）作標(biāo)記物，充分利用激發(fā)光與發(fā)射光之間的降移與發(fā)射光較長的半壽期，在激發(fā)光后延時(shí)測(cè)量發(fā)射光的強(qiáng)度。進(jìn)一步尋找提高檢測(cè)敏感性的熒光標(biāo)記物，提高準(zhǔn)確性及自動(dòng)化程度，改進(jìn)多元檢測(cè)平臺(tái)的方法學(xué)是未來免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向。在今后的研究中，免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)將更進(jìn)一步顯示其巨大的優(yōu)越性，同時(shí)也將在更廣闊的領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮其作用。這兩種方法都是以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記物與之反應(yīng)形成可通過激發(fā)產(chǎn)生熒光的結(jié)果，從而達(dá)到檢測(cè)目的。如果待檢血清中沒有相應(yīng)抗體，熒光標(biāo)記物將不會(huì)與包被在檢測(cè)線上的抗原或抗體結(jié)合，熒光標(biāo)記物不會(huì)富集，檢測(cè)線上不會(huì)出現(xiàn)能產(chǎn)生熒光的檢測(cè)線。RIA法測(cè)定血清蛋白靈敏度高、特異性強(qiáng)，可準(zhǔn)確定量到ng／ml水平。最后根據(jù)熒光強(qiáng)度，即可對(duì)蛋白抗原進(jìn)行定量。該法重復(fù)性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。作為一種均相標(biāo)記免疫分析技術(shù)，熒光偏振免疫方法與其它非均相標(biāo)記免疫方法相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：1）抗原抗體間的反應(yīng)和樣品分于的測(cè)定在溶液中進(jìn)行進(jìn)免了固相標(biāo)記過程中反復(fù)多次的洗滌步驟屆于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制和提高分析方法的精度，F(xiàn)PIA方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（CV一般可控制在 3％－5％之間；2）檢測(cè)過程僅需樣品、示蹤劑和抗體的加入和混勻數(shù)分鐘甚至數(shù)秒鐘孵育后即可測(cè)定熒光偏振光強(qiáng)度方法的測(cè)定速度快有利于大批量樣品的分析測(cè)試；（3）因?yàn)闊晒馄癫皇軆?nèi)濾作用的影響，對(duì)于有顏色和渾濁的溶液仍能很好地完成檢測(cè)任務(wù)：（4）不需要使用放射性問位素避免了污物不易處理的難題。發(fā)射出的光子經(jīng)過偏振儀形成525一550nm的偏振光,這一偏振光的強(qiáng)度與熒光素受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反比,游離的熒光素標(biāo)記抗原,分子小,轉(zhuǎn)動(dòng)速度快,激發(fā)后發(fā)射的光子散向四面八方,因此通向偏振儀的光信號(hào)很弱,而與抗體大分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗原,因分子大,分子的轉(zhuǎn)動(dòng)慢,激發(fā)后產(chǎn)生的熒光比較集中,因此偏振光信號(hào)比未結(jié)合時(shí)強(qiáng)得多。作定量檢測(cè)，可根據(jù)HBsAb 的含量判斷機(jī)體對(duì)HBV的免疫狀態(tài)及乙肝疫苗的免疫效果。HBV—DNA陰性并不完全代表體內(nèi)HBV已被清除，結(jié)合“兩對(duì)半”各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體內(nèi)HBV病毒狀態(tài)。而低濃度的抗Hbc一般為恢復(fù)期或既往感染。高濃度的HBeAb一方面提示病情好轉(zhuǎn)，而在某些時(shí)候（如肝功能指標(biāo)很差）則可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。如HBsAg濃度降低，HBsAb濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復(fù)期發(fā)展；反之，HBsAg濃度處于較高水平或上升趨勢(shì)，而HBsAb一直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。乙肝孕婦進(jìn)行定量檢查，有助于使部分病人得到及時(shí)的正確的診斷 時(shí)間分辨熒光免疫定量測(cè)定乙肝兩對(duì)半的臨床意義 目前我科已正式開展了乙肝二對(duì)半的TRFIA定量分析，其每一項(xiàng)的正常值范圍均是由我國衛(wèi)生部根據(jù)美國雅培的標(biāo)準(zhǔn)而制定，其靈敏度，準(zhǔn)確度，及精確度都有遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般的ELISA法，乙肝兩對(duì)半的定量制定將給臨床提供一個(gè)關(guān)于乙肝診斷及療效，預(yù)后判斷的更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。)，TRF為目前檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記物最理想的方法。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?。?ng/ml。其中增強(qiáng)液的作用是使熒光信號(hào)增強(qiáng)。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TRFIA）是針對(duì)這缺點(diǎn)加以改進(jìn)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用于生物酶含量及活性測(cè)定、臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品檢驗(yàn)。 2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用最廣。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。常用的熒光色素有： （一）熒光色素 1． 異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無法像 WB 那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一個(gè)完美的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。免疫熒光介紹 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。 該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無從談起。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在 4℃或20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。 2． 四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其他如堿性酸酶的底物4甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。而且用于鑒定的材料也比較多樣，可以是培養(yǎng)物、感染組織、分泌排泄物，也可以是土壤、水、雜物等。: 以常用熒光素作為標(biāo)記物的熒光免疫測(cè)定往往受血清成分、試管、儀器組件等的本底熒光干擾，以及激發(fā)光源的雜射光的影響，使靈敏度受到很大限制。以雙抗體夾心法為例的測(cè)定反應(yīng)程序見圖175。所用檢測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光計(jì)，與一般的熒光分光光度計(jì)不同，采用脈沖光源（每秒閃爍1000次的氙燈），照射樣品后即短暫熄滅，以電子設(shè)備控制延緩時(shí)間，待非特異本底熒光衰退后，再測(cè)定樣品發(fā)出的長鑭系熒光。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，因此加入一種增強(qiáng)劑，使Eu3+從復(fù)合物上解離下來，自由Eu3+同增強(qiáng)劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號(hào)增強(qiáng)了百萬倍。其中時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRF）為近年新研制成功的用三價(jià)稀土離子作為示蹤物，以單克隆抗體包被支持物與樣品中抗原反應(yīng)，再加入用銪（EU）標(biāo)記的抗體，進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè)，可大大降低一般同位素和熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)性，該TRF法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記物較其他方法靈敏