臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理-全文預(yù)覽
【正文】 制劑、消耗品(如反應(yīng)管，吸頭)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備(如加樣器、離心機(jī))等。 由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主要來(lái)源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測(cè)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對(duì)、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。 核酸的擴(kuò)增下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行充分評(píng)價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。(五)標(biāo)本的處理(核酸提取)用于DNA測(cè)定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris1 mmol/L EDTA緩沖液(pH )中4℃保存。如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。臨床用于RNA(如HCV RNA)擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時(shí)以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。在使用 PCRELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可使用體積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺(tái)。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。(三)擴(kuò)增區(qū)用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對(duì)容易。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過夜。工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。對(duì)于熱啟動(dòng)技術(shù)(在第一個(gè)高溫變性步驟后加入酶 )，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個(gè)主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理使基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，特制定本規(guī)范。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速
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