臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理-wenkub.com
2025-08-02 01:52 本頁面
【正文】 所有開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的全國臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評價(jià)，評價(jià)結(jié)果將作為其開展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的依據(jù)之一。定量測定則必須報(bào)告量的多少，如結(jié)果高于測定方法線性范圍上限，則對樣本稀釋后再測，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測定范圍下限，則報(bào)？多少即可，不能報(bào)告為0或陰性。（3）板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。 每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控（污染監(jiān)測質(zhì)控），為判斷擴(kuò)增過程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。這些質(zhì)控樣本在擴(kuò)增檢測時(shí)必須使用與患者的標(biāo)本相同的主反應(yīng)混合液。 對于DNA測定內(nèi)標(biāo)可使用對有機(jī)體存活所必須的靶基因如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會(huì)表現(xiàn)為陰性結(jié)果。 測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價(jià)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。 最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳，這一點(diǎn)跟DNA分離相同。僅用光度計(jì)比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。 常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。由于核酸擴(kuò)增測定的高敏感性，所以標(biāo)本制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增本身和產(chǎn)物分析中的每一步都要求有質(zhì)控措施 室內(nèi)質(zhì)量控制(九)質(zhì)量控制溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性，還會(huì)給檢測信號的特異性帶來負(fù)面影響。雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對、對探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來自以前測定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測定的污染。在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒?yàn)設(shè)備的污染。 測定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來自非病人標(biāo)本來源的核酸。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對其后的 Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。用于RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中80℃或液氮中貯存。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報(bào)告等。
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1